1GB/TXXXXX—XXXX保健食品中大豆異黃酮的測定本文件描述了保健食品中大豆異黃酮的測定方法。本文件適用于片劑、硬膠囊、軟膠囊、口服液、酒劑等劑型形態(tài)保健食品中大豆異黃酮的測定。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本標準。3.1大豆異黃酮soybeanisoflavone大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素、染料木素6種黃酮類物質(zhì)的總稱。4原理試樣經(jīng)80%甲醇溶液提取、過濾后，經(jīng)高效液相色譜(烷基鍵合的表面多孔型反向色譜柱）分離、紫外檢測器檢測，以保留時間定性，外標法定量。5試劑和材料除非另有規(guī)定，僅使用色譜純試劑。5.1試劑5.1.1水，按GB/T6682規(guī)定的一級水。5.1.2乙腈（CH3CN）。5.1.3甲醇（CH3OH）。5.1.4二甲基亞砜（C2H6OS）。5.2試劑配制5.2.180%甲醇溶液：量取800mL甲醇（5.1.3），加水稀釋至1000mL，混勻。5.2.20.01%磷酸水溶液：吸取0.1mL磷酸，加水稀釋至1000mL，混勻。2GB/TXXXXX—XXXX5.2.350%甲醇溶液：量取50mL甲醇（5.1.3），加水稀釋至100mL，混勻。5.3標準物質(zhì)或標準樣品5.3.1大豆苷標準品（C21H20O9,CAS:552-66-9）標準品：純度≥98%，或經(jīng)國家認證并授予證書的標準物質(zhì)或標準樣品。5.3.2黃豆黃苷標準品（C22H22O10,CAS:40246-10-4）標準品：純度≥98%，或經(jīng)國家認證并授予證書的標準物質(zhì)或標準樣品。5.3.3染料木苷標準品（C21H20O10,CAS:529-59-9）標準品：純度≥98%，或經(jīng)國家認證并授予證書的標準物質(zhì)或標準樣品。5.3.4大豆苷元標準品（C15H10O4,CAS:486-66-8）標準品：純度≥98%，或經(jīng)國家認證并授予證書的標準物質(zhì)或標準樣品。5.3.5黃豆黃素標準品（C16H12O5,CAS:40957-83-3）標準品：純度≥98%，或經(jīng)國家認證并授予證書的標準物質(zhì)或標準樣品。5.3.6染料木素標準品（C15H10O5,CAS:446-72-0）標準品：純度≥98%，或經(jīng)國家認證并授予證書的標準物質(zhì)或標準樣品。5.4標準溶液配制5.4.1大豆異黃酮標準儲備液（1000μg/mL）精密稱取大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素和染料木素各約25mg，分別置于25mL棕色容量瓶中，加入5mL~15mL二甲基亞砜（5.1.4）超聲至充分溶解，用甲醇定容至刻度，混勻，使?jié)舛燃s為1000μg/mL。在4℃冰箱中貯存，有效期3個月。5.4.2大豆異黃酮混合標準溶液分別精密移取大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷三種標準儲備液（5.4.1）各2.5mL，精密移取大豆苷元、黃豆黃素、染料木素三種標準儲備液（5.4.1）各0.5mL于10mL容量瓶中混合，用甲醇定容至刻度，混勻。該大豆異黃酮混合標準溶液中大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷濃度分別約為250μg/mL，大豆苷元、黃豆黃素、染料木素濃度分別約為50μg/mL。在4℃冰箱中貯存，有效期3個月。5.4.3大豆異黃酮標準系列工作液分別精密移取混合標準溶液（5.4.2）0.2mL、2.0mL、4.0mL、10.0mL、20.0mL，用50%甲醇溶2.0μg/mL、4.0μg/mL、10.0μg/mL、20.0μg/mL。5.5材料5.5.1微孔濾膜：0.45μm，有機相。6儀器和設(shè)備6.1高效液相色譜儀：帶紫外檢測器或相當者。6.2超聲波清洗器。6.3分析天平：感量0.1mg。6.4離心機：轉(zhuǎn)速不低于8000r/min。3GB/TXXXXX—XXXX6.5高速粉碎機。7分析步驟7.1試樣制備a）固體（硬膠囊、片劑等）：取不少于20?；虿簧儆?0g樣品，硬膠囊取內(nèi)容物，必要時經(jīng)高速粉碎機或研缽磨成粉狀，封存?zhèn)溆?；b）半固體（軟膠囊）：取不少于20?；虿簧儆?0g樣品，剪開，擠出內(nèi)容物，研細（必要時）混勻；c）液體（口服液、酒劑）：取5支獨立包裝樣品（如有），混合均勻，試樣測定前振搖混勻。7.2試樣處理7.2.1固體樣品、半固體樣品精密稱取樣品0.1g～0.5g(精確至0.1mg)，置于50mL具塞離心管中，加入80%甲醇溶液（5.2.1）40mL，混合均勻后震蕩10min，超聲提取20min，冷卻至室溫，將試樣溶液轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶中。用80%甲醇溶液（5.2.1）沖洗離心管，將全部洗滌液轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶中，并用80%甲醇溶液（5.2.1）定容。取適量溶液置于離心管中，8000r/min離心5min，取上清液經(jīng)0.45μm濾膜過濾（建議棄初濾液1mL以上），備用。7.2.2液體樣品精密移取混勻的液體樣品1.0mL~5.0mL于50mL具塞離心管中，加入80%甲醇溶液（5.2.1）40mL，混合均勻后震蕩10min，超聲提取20min，冷卻至室溫，轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶中。用80%甲醇溶液（5.2.1）沖洗離心管，全部洗滌液轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶中，并用80%甲醇溶液（5.2.1）定容。取適量溶液置于離心管中，8000r/min離心5min，取上清液經(jīng)0.45μm濾膜過濾（建議棄初濾液1mL以上備用。注：酒劑等能與80%甲醇溶液(5.2.1)完全混溶的樣品，可不經(jīng)過震蕩、超聲提取和離心操作。7.3色譜參考條件液相色譜參考條件如下：a)色譜柱：烷基鍵合的表面多孔型反向色譜柱（4.6×250mm×5μm），或等效色譜柱；b)流動相：A相為乙腈，B相為0.01%磷酸水溶液(5.2.2)，梯度洗脫條件見表1；c)流速：1.0mL/min；d)波長：260nm；e)進樣量：10μL；f)柱溫：30℃。表1梯度洗脫條件時間/min02360流動相A/%24流動相B/%207.4標準曲線的制作4GB/TXXXXX—XXXX將標準系列溶液由低濃度到高濃度依次注入液相色譜儀中，測定各組分相應的峰面積（標品色譜圖見附錄A圖A.1以標準工作液中各異黃酮濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。必要時，可適當增加或減少稀釋倍數(shù)f，使試樣中待測物質(zhì)量濃度在標準曲線范圍內(nèi)。7.5試樣溶液的測定將試樣溶液注入液相色譜儀中，以保留時間定性，得到各目標化合物相應的峰面積（樣品色譜圖見圖A.2），根據(jù)標準曲線得到待測液中各物質(zhì)濃度。8結(jié)果計算8.1試樣中大豆異黃酮各組分[大豆苷（X1）、黃豆黃苷（X2）、染料木苷（X3）、大豆苷元（X4）、黃豆黃素（X5）、和染料木素（X6）]的含量分別按式（1）計算：×100…………………Xi——樣品中大豆異黃酮單一組分的含量，單位為克每百克(g/100g)或克每百毫升(g/100mL)；Ci——根據(jù)標準曲線得出的大豆異黃酮單一組分的濃度，單位為微克每毫升(μg/mL）；V——試樣溶液體積，單位為毫升(mL)；f——樣品稀釋倍數(shù)；m——試樣取樣量，單位為克或毫升（g或mL）；1000、1000、100——單位換算系數(shù)。8.2試樣中大豆異黃酮總含量，按式（2）計算：X=X1+X2+X3+X4+X5+X6………………（2）式中：X——試樣中大豆異黃酮總含量，單位為克每百克(g/100g)或克每百毫升(g/100mL)；X1——試樣大豆苷元的含量，單位為克每百克(g/100g)或克每百毫升(g/100mL)；X2——試樣黃豆黃素的含量，單位為克每百克(g/100g)或克每百毫升(g/100mL)；X3——試樣染料木素的含量，單位為克每百克(g/100g)或克每百毫升(g/100mL)；X4——試樣大豆苷的含量，單位為克每百克(g/100g)或克每百毫升(g/100mL)；X5——試樣黃豆黃苷的含量，單位為克每百克(g/100g)或克每百毫升(g/100mL)；X6——試樣染料木苷的含量，單位為克每百克(g/100g)或克每百毫升(g/100mL)。計算結(jié)果以重復性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的算術(shù)平均值表示，結(jié)果保留三位有效數(shù)字。9精密度在重復性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的10%。固體和半固體試樣：當稱樣量為0.10g，定容體積為50mL時，大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素、染料木素的檢出限為0.001g/100g，定量限為0.003g/100g。5GB/TXXXXX—XXXX液體試樣：當取樣量為1.0mL，定容體積為50mL時，大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素、染料木素的檢出限為0.0001g/100mL，定量限為0.0003g/100mL。GB/TXXXXX—XX