ICS11.220B41DB21DB21/T2468—2015新城疫免疫抗體監(jiān)測(cè)技術(shù)規(guī)范TechnicalspecificationformonitoringimmuneantibodyofNewcastledisease遼寧省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布IDB21/T2468—2015本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1-2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由遼寧省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心提出。本標(biāo)準(zhǔn)由遼寧省畜牧獸醫(yī)局歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：遼寧省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心、遼寧省動(dòng)物醫(yī)學(xué)研究院。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：王宏燕、趙曉彤、薛樹山、閆海濱、馬建山、石霖、李清竹、吳運(yùn)譜、何欣、王志國、趙鵬、李曉楠。1DB21/T2468—2015本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了新城疫免疫抗體監(jiān)測(cè)技術(shù)中的樣品采集和制備、血凝試驗(yàn)、血凝抑制試驗(yàn)的操作規(guī)程和綜合判定。本標(biāo)準(zhǔn)適用于新城疫疫苗免疫抗體監(jiān)測(cè)。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T16550-2008新城疫診斷技術(shù)3縮略語下列縮略語適用于本標(biāo)準(zhǔn)。HA：血凝（hemagglutination）HAU：血凝單位（hemagglutinationunit）HI：血凝抑制（hemagglutinationinhibition）4器材與試劑4.1器材：普通天平、分析天平、普通離心機(jī)、微型振蕩器、冰箱、高壓滅菌器、微量移液器、滴頭、96孔90度V形血凝反應(yīng)板。4.2阿氏液(Alsever'sSolution)：配制方法參見附錄A中A.1。4.3pH7.20.01mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS）：配制方法參見附錄A中A.2。4.41%雞紅細(xì)胞懸液：配制方法參見附錄A中A.3。4.5標(biāo)準(zhǔn)新城疫病毒抗原、陽性對(duì)照血清和陰性對(duì)照血清。5抽樣樣本量大小的確定5.1無限群抽樣樣本量n值的計(jì)算按照預(yù)期新城疫免疫抗體合格率為70%,可接受的最大絕對(duì)誤差為5%，置信水平為95%，根據(jù)公式n=p(1-p)×z2/e2計(jì)算出n值，其中z值為95%置信水平對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)分布1-α/2百分位點(diǎn)，為1.96，將p=0.7、z=1.96、e=0.05計(jì)算出n值為323。5.2有限群抽樣樣本量nα值的計(jì)算根據(jù)公式nα=n×N/(N+n)，計(jì)算出群體實(shí)際抽樣數(shù)量，其中N為群體數(shù)量，nα為抽樣數(shù)量。2DB21/T2468—20156樣品采集和制備6.1血液采集將雞側(cè)臥保定后，用酒精棉球消毒翅靜脈窩區(qū)，在距離翅靜脈窩約0.3cm處，使針管與近心端保持45度進(jìn)針，稍稍將針頭輕插進(jìn)血管，輕拉活塞，當(dāng)有血液開始被吸出后，保持注射器位置不動(dòng)，讓血液緩緩吸入注射器針管內(nèi)，達(dá)到所需的采血量后，用棉球壓迫血管上的傷口約30s。6.2血清分離采集到血液后，立即將針頭拔掉，把注射器內(nèi)的血液沿著試管壁徐徐注入，不能有氣泡，也不能振蕩。逐一編號(hào)，仔細(xì)核對(duì)，傾斜放置。血液樣品夏天在常溫下、冬天在25℃~37℃溫箱中放置1h左右，析出血清。6.3血清運(yùn)輸運(yùn)輸時(shí)將血清與采樣記錄一同裝入隔熱堅(jiān)固、內(nèi)裝適當(dāng)冷凍劑和防震材料的專用運(yùn)輸容器中。外包裝上要加貼生物安全警示標(biāo)志。6.4血清保存血清保存在-20℃~-70℃低溫冰箱中，避免反復(fù)凍融。7HA試驗(yàn)方法7.1取新城疫病毒抗原1瓶，加入2mLPBS，充分溶解，制成新城疫病毒抗原懸液。7.2取孔面規(guī)整、內(nèi)壁光滑的96孔90度V型血凝反應(yīng)板，在A1～C12孔中加入0.025mLPBS。7.3吸取0.025mL新城疫病毒抗原懸液，加入A1～C1孔，吹打3～5次充分混勻。7.4從A1～C1孔吸取0.025mL加入第A2～C2孔，混勻后吸取0.025mL加入A3～C3孔，依次進(jìn)行倍比稀釋至A11～C11孔，最后從A11～C11孔吸取0.025mL棄去。7.5A1～C12孔補(bǔ)加0.025mLPBS。7.6A1～C12孔加入1%雞紅細(xì)胞懸液，A12～C12孔為紅細(xì)胞對(duì)照。7.7振蕩混勻后，在20℃~25℃的條件下靜置40min后觀察結(jié)果。7.8當(dāng)紅細(xì)胞對(duì)照孔A12～C12孔中的紅細(xì)胞呈明顯的鈕扣狀沉到孔底時(shí)，判定結(jié)果。以完全凝集紅細(xì)胞的病毒抗原懸液的最大稀釋倍數(shù)為該抗原的血凝滴度。完全凝集紅細(xì)胞的病毒抗原懸液的最大稀釋倍數(shù)為1個(gè)血凝單位（HAU）。8HI試驗(yàn)方法8.14HAU抗原配制按照GB/T16550-2008新城疫診斷技術(shù)的要求配制4個(gè)血凝單位（4HAU）的新城疫病毒抗原。8.24HAU抗原回滴8.2.1取血凝反應(yīng)板，在A1～C5孔加入0.025mLPBS。8.2.2吸取0.025mL4HAU新城疫病毒抗原，加入A1～C1孔，混勻后倍比稀釋至A4～C4孔，混勻后吸取0.025mL棄去。3DB21/T2468—20158.2.3A1～C5孔中補(bǔ)加0.025mLPBS。8.2.4A1～C5孔加入1%雞紅細(xì)胞懸液，A5～C5孔為紅細(xì)胞對(duì)照。8.2.5振蕩混勻后，在20℃~25℃條件下靜置40min后觀察結(jié)果。8.2.6當(dāng)紅細(xì)胞對(duì)照孔A5～C5孔中的紅細(xì)胞呈明顯的鈕扣狀沉到孔底時(shí)，判定結(jié)果。A1～C2孔完全凝集，則4HAU抗原配制準(zhǔn)確；僅A1～C1孔完全凝集或A1～C2孔均有紅細(xì)胞流淌，需補(bǔ)加病毒抗原；A1～C3孔或A1～C4孔完全凝集，需補(bǔ)加PBS。若4HAU抗原回滴出現(xiàn)上述后兩種情況，則需要重新回滴，直至回滴準(zhǔn)確。8.3HI試驗(yàn)操作8.3.1取血凝反應(yīng)板，在A1～H11孔加入0.025mLPBS，A12～H12加入0.05mLPBS。8.3.2吸取待檢血清0.025mL加入A1～A6孔中，吸取新城疫陽性血清加入A7孔，陰性血清加入A8孔，混勻后，同時(shí)倍比稀釋至A10～H10，混勻后棄去0.025mL。8.3.3A1～H11孔加入回滴好的4HAU抗原，A11～H11為4HAU抗原對(duì)照。8.3.4振蕩混勻后，在室溫20℃~25℃條件下放置30min。8.3.5A1～H12加入1%雞紅細(xì)胞懸液，A12～C12孔為紅細(xì)胞對(duì)照。8.3.6振蕩混勻后，在20℃~25℃條件下靜置40min后觀察結(jié)果。9HI效價(jià)判定當(dāng)紅細(xì)胞對(duì)照孔A12～H12孔中的紅細(xì)胞呈明顯的鈕扣狀沉到孔底，且4HAU抗原對(duì)照孔A11~H11孔完全凝集時(shí)，進(jìn)行結(jié)果判定。將血凝反應(yīng)板傾斜，參照對(duì)照孔，與紅細(xì)胞對(duì)照孔中的紅細(xì)胞淚滴大小、流速一致的血清的最高稀釋倍數(shù)為該血清的HI效價(jià)。當(dāng)陰性血清的HI效價(jià)不大于2㏒2，陽性血清的HI效價(jià)與已知效價(jià)相差1個(gè)稀釋度范圍，HI試驗(yàn)結(jié)果判定有效。10免疫抗體結(jié)果判定10.1血清HI效價(jià)＜5㏒2，判為新城疫免疫抗體陰性；血清HI效價(jià)≥5㏒2，判為新城疫免疫抗體陽性。10.2免疫抗體合格數(shù)量占檢測(cè)總數(shù)的70%（含）以上，判該群體新城疫免疫抗體合格。4DB21/T2468—2015（資料性附錄）試劑配制A.1阿氏液(Alsever'sSolution)葡萄糖2.05g檸檬酸鈉0.8g檸檬酸0.055g氯化鈉0.42g加蒸餾水100mL，散熱溶解后調(diào)pH值至6.1，69kPa15min高壓滅菌，4℃保存?zhèn)溆?。A.2pH7.20.01mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS）A.2.1配制25×PB磷酸氫二鈉2.74g磷酸二氫鈉0.79g加蒸餾水100ml。A.2.2配制1×PBS25×PB40ml氯化鈉