納米抗體研究進展綜述摘要：單域抗體因其獨特的優(yōu)勢，如水溶性好、分子量小、穩(wěn)定性好、免疫原性小等一系列特點，在生物研究和醫(yī)學領域中的作用愈發(fā)廣泛。在疾病診斷、病原檢測、癌癥疾病治療、藥物殘留檢測分析，壞境檢測，用作sdAbs分子探針、分子診斷和顯影等等領域具有廣闊的應用前景。納米抗體因其優(yōu)勢，可實現(xiàn)重組表達，從而使得生產(chǎn)周期和生產(chǎn)成本均可大幅下降，是目前國內(nèi)外研發(fā)的熱點。作者重點介紹了納米抗體的特點，然后簡述了納米抗體的制備流程，簡述了納米抗體在疾病診斷、疾病治療、食品安全和環(huán)境監(jiān)測等領域的應用，最后對納米抗體的應用前景進行了分析和展望。1介紹自1890年，第一種抗體——抗毒素，這是在血清中發(fā)現(xiàn)的第一種抗體［１］。這是一種可中和外毒素的物質(zhì)，1975年，雜交瘤技術的誕生開始了抗體研究和應用快速發(fā)展的時代。由于抗體可特異性識別和結合抗原的特性，使其在疾病診斷、疾病治療、藥物運載、病原、毒素和小分子化合物檢測等領域具有廣泛的應用［２］。但通過單克隆抗體技術制備的傳統(tǒng)單克隆抗體有其不可忽視的缺點：生產(chǎn)耗時長、成本高、在組織和腫瘤中穿透力差、長期使用會引起機體免疫排斥反應以及動物道德問題等。相比于傳統(tǒng)抗體，納米抗體具備傳統(tǒng)抗體不具備的分子質(zhì)量小和穿透性強的優(yōu)勢而成為現(xiàn)在抗體研究的主要方向之一。單鏈抗體（singlechainantibodyfragment,scFv）就是新型小分子抗體的一種，其穿透力更強、生產(chǎn)成本更低，但scFv抗體存在溶解度低、穩(wěn)定性較差、表達量低、易聚合和親和力低的缺點［３］。1989年，比利時免疫學家Hamers-Casterman在駱駝血清中的偶然發(fā)現(xiàn)一種天然缺失輕鏈的重鏈抗體（HcAbs）可以解決scFv所存在的問題，重鏈抗體只包含２個常規(guī)的CH2與CH3區(qū)和１個重鏈可變區(qū)（ＶＨＨ），重鏈可變區(qū)具有與原重鏈抗體相當?shù)慕Y構穩(wěn)定性以及與抗原的結合活性，是已知的可結合目標抗原的最小單位，其分子質(zhì)量只有單克隆抗體的1/10，是迄今為止獲得的結構穩(wěn)定且具有抗原結合活性的最小抗體單位，因此也被稱作納米抗體（nanobody,Nb）［４］。與傳統(tǒng)抗體相比，納米抗體的分子質(zhì)量小、比表面積大，體積小、具有耐熱性強、穩(wěn)定性高、組織穿透力強、抗原結合能力強、水溶性好、易于通過體外重組表達高質(zhì)量穩(wěn)定生產(chǎn)等優(yōu)點，在疾病診斷、病原檢測、疾病治療、藥物殘留分析、環(huán)境監(jiān)測等領域具有巨大的應用潛力，近年來受到了極大關注［５］。作者首先概述了納米抗體的制備方法和理化性能，然后重點介紹了納米抗體的臨床應用，并展望了其在獸醫(yī)臨床的應用前景?？乖M入生物體后，經(jīng)過一系列反應刺激B細胞分化成漿細胞，進而分泌抗體?？贵w是可以特異性的與相應抗原結合的免疫球蛋白。傳統(tǒng)意義上的抗體形態(tài)通常呈“Y”字形結構[6],具有4條多肽鏈組成的對稱結構。兩條較長、相對分子量較大的重鏈和兩條較短、相對分子量較小的輕鏈。每條重鏈上含有一個可變區(qū)（VH），三個恒定區(qū)（CH1、CH2、CH3）；輕鏈含有一個可變區(qū)(VL)和一個恒定區(qū)（CL）。1993年，Hamers-CasermanC等[7]，在單峰駱駝的血清中發(fā)現(xiàn)了大量M(r)為100kD的IgG樣物質(zhì)存在，這種抗體不同于傳統(tǒng)抗體IgG，還存有這些分子天然缺失輕鏈，僅由重鏈二聚體組成，但卻有廣泛的抗原結合庫。含有重鏈IgG（heavy-chainIgG,hcIgG）[6]是駱駝科動物的一個普遍特征，盡管其所占比例稍有差別，如在南美洲羊駝的血液中重鏈抗體所占比例為10%-25%，而在普通雙峰駝中則高達50%-89%[8,9],這一發(fā)現(xiàn)讓人們對輕鏈在駱駝體內(nèi)的作用產(chǎn)生了質(zhì)疑，并且為抗體工程研究開辟了新的前景。在單峰駱駝的血清中發(fā)現(xiàn)了分子天然缺失輕鏈，僅由重鏈二聚體組成的抗體。含有重鏈IgG是駱駝科動物的一個普遍特征因為這些抗體輕鏈缺失，所以被稱為重鏈抗體，這是歷史上人們首次發(fā)現(xiàn)天然缺失輕鏈的HCAbs。隨即又在某些軟骨魚的血液中，除了有異源四聚體的IgM和IgW抗體外，還有一種與HCAbs相似，天然缺失輕鏈的Ig重鏈抗體，被稱為新抗原受體(Immunoglobulinnewantigenreceptor,IgNAR)[10-12]。它是由兩條重鏈組成的二聚體，每條重鏈由５個恒定區(qū)、一個鉸鏈區(qū)和一個可變區(qū)組成。在駱駝科中，重鏈的可變域，被稱為重鏈可變區(qū)片段(VariabledomainoftheHeavychainoftheHeavy-chainantibody,VHH)[6]，而在軟骨魚類中被稱為藍魚新抗原受體可變區(qū)片段(VariabledomainofthesharkNewAntigenReceptor,VNAR)［10］。1997年，Ghaahroudi等[13]經(jīng)過淘選成功獲得了只含有一個結構域的最小單元抗原結合片段，被稱為單域抗體(single-domainantibodies,sdAbs)。這些可變結構域可以在細菌、酵母或其他宿主中以重組sdAbs的形式表達。其后，研究人員又從ＶＮＡＲ基因庫[13]中獲得了結構相似的sdAbs。這種橢球形的小分子抗體相對分子質(zhì)量僅有15kDa，其直徑僅為2.5nm，長4nm，因此也被稱為納米抗體(Nbs,Nanobodies)[12]。由于其特異性高、親和力和穩(wěn)定性強等固有性質(zhì)，使得sdAbs很快成為醫(yī)學領域的焦點。２納米抗體的應用納米抗體在疾?。ɡ绨┌Y、感染性疾?。┑脑\斷中應用，在小分子化合物檢測，例如獸藥殘留檢測、農(nóng)藥殘留檢測。納米抗體在重金屬殘留、微生物毒素檢測中也存在有效應用。3納米抗體在臨床應用中的展望納米抗體由于其獨特的優(yōu)勢：分子質(zhì)量小、結構穩(wěn)定、特異性強、組織穿透性強、可溶性好、免疫原性弱、生產(chǎn)成本低的優(yōu)點，使其在癌癥疾病診斷與治療、病原分析治療、藥物殘留檢測和污染物環(huán)境監(jiān)測中都有著廣泛應用。得益于抗體工程技術和噬菌體篩選技術的快速發(fā)展，使納米抗體的快速篩查和大量高質(zhì)量穩(wěn)定生產(chǎn)變得更容易，降低了生產(chǎn)成本在腫瘤診斷與治療，食品環(huán)境檢測重金屬與污染物，食源性動物藥物殘留中的應用中得到了保證。雖然近年來納米抗體的生產(chǎn)和應用取得了快速的發(fā)展，但由于其蛋白質(zhì)屬性，進入體內(nèi)后很容易被蛋白酶分解，較短的半衰期使體內(nèi)應用需要頻繁給藥才能達到預期效果。此外，臨床上長期使用納米抗體是否會產(chǎn)生免疫反應，以及納米抗體進行人源化改造后是否降低了免疫原性也未被證實。納米抗體不包含Ｆｃ結構域，因此納米抗體不具有細胞毒性效應(ADCC)和補體毒性效應(CDC)，抗體依賴的細胞介導的ADCC以及補體依賴的CDC可以殺死癌細胞。另外，獲得特異性納米抗體的免疫動物的費用高和篩選過程相對復雜且成本較高。納米抗體沒有ADCC和CDC的缺點，學者可利用細胞工程或基因工程將Fc片段進行改造并轉接到納米抗體上。針對人源化改造后是否降低了免疫原性問題，國內(nèi)科學家正在采用計算機模擬或與人胚系基因對比分析進行人源化改造或采用框架抑制技術改造進行免疫原性試驗檢測。為了解決納米抗體半衰期短的缺點，許多科學家利用聚乙二醇、血清白蛋白特異的小化學物修飾與在血液中具有長半衰期的構象紊亂的蛋白進行基因融合，通過結合大量血清蛋白來延長納米抗體的半衰期。同時免疫接種動物費用高的問題，可以通過其他小型試驗動物來代替羊駝。近年來，Nb在酶聯(lián)免疫吸附檢測[14-16]、熒光免疫吸附檢測[17]、化學發(fā)光酶免疫分析檢測[18-19]、電化學發(fā)光免疫分析[20]、免疫組化[21]以及免疫PCR[22-23]等免疫檢測技術中得到了研發(fā)和應用。MORRISONSL.Invitroantibodies:Strategiesforproductsandapplication[J].AnnualReviewofImmunology,1992,10:239-265KOHLERG,MILSTEINC.ContinuousculturesoffusedcellssecretingantibodyofpredefinedspecificityNature(Lond.)[J].JournalofImmunology,2005,174(5):2453-2455.

FAO,TheStateofWorldFisheriesandAquaculture,FoodandAgricultureOrganizationoftheUnitedNations,ROME-Italia,2020.CRASSONORHAZINJACQUINOetal.Enzymaticfunctionalizationofananobodyusingproteininsertiontechnology[J].ProteinEngineeringDesign&Selection,2015,28(10):451-460.HAMERSCASTERMANCATARHOUCHTMUYLDERMANSS,etal.Naturallyoccurringantibodiesdevoidoflightchains[J].Nature,1993，363(6428):446-448.王蘭東馮東曉張淑敏納米抗體研究進展[J]生物技術通訊201627(3)453-458.WANGLDFENGDXZHANGSM.Researchprogressofnanobody[J].LettersinBiotechnology.2016,27(3):453-458.(inChinese)OIE,WorldOrganizationforAnimalHealth-AquaticAnimalHealthCode,2020.Paris,France.M.R.Blanc,A.Anouassi,M.AhmedAbed,etal.Aone-stepexclusion-bindingprocedureforthepurificationoffunctionalheavy-chainandmammalian-typegamma-globulinefromcamelidsera[J].BiotechnolApplBiochem,2009,54(4):207-212.E.A.DeSimone,Saccodossi,A.Ferrari,etal.DevelopmentofELISAsforthemeasurementofIgMandIgGsubclassesinserafromllamas(Lamaglama)andassessmentofthehumoralimmuneresponseagainstdifferentantigens[J].VetImmunolImmunopathol,2008,126(1-2):64-73.Greenberg,S.Avila.M.Hughes,etal.Anewantigenreceptorgenefamilythatundergoesrearrangementandextensivesomaticdiversificationinsharks[J].Nature,1995,374(6518):168-173M.F.Flajnik,N.Deschacht,S.Muyldermans.Acaseofconvergence:whydidasimplealternativetocanonicalantibodiesariseinsharksandcamels?[J].PLoSBiol,2011,9(8):e1001120.M.Kovaleva.L.Ferguson,J.Steven,etal.Sharkvariablenewantigenreceptorbiologics-anoveltechnologyplatformfortherapeuticdrugdevelopment[J].ExpertOpinBiolTher,2014,14(10):1527-1539.M.ArbabiGhahroudi,A.Desmyter,L.Wyns,etal.Selectionandidentificationofsingledomainantibodyfragmentsfromcamelheavy-chainantibodies[J].FEBSLett,1997,414(3):521-526.S.D.Nuttall,U.V.Krishnan,M.Hattarki,etal.Isolationofthenewantigenreceptorfromwobbegongsharks,anduseasascaffoldforthedisplayofproteinlooplibraries[J].MolImmunol,2001,38(4):313-326.F.Rahbarizadeh,D.Ahmadvand,Z.Sharifzadeh.Nanobody;anoldconceptandnewvehicleforimmunotargeting[J]ImmunolInvest,2011,40(3):299-338CuiY,LiD,MorisseauC,etal.Heavychainsingle-domainantibodiestodetectnativehumansolubleepoxidehydrolase.AnalBioanalChem,2015,407:7275-83HeY,RenY,GuoB,etal.DevelopmentofaspecificnanobodyanditsapplicationinrapidandselectivedeterminationofSalmonellaenteritidisinmilk.FoodChem,2020,310:125942LiuX,TangZ,DuanZ,etal.Nanobody-basedenzymeimmunoassayforochratoxinAincerealwithhighresistancetomatrixinterference.Talanta,2017,164:154-8WangJ,MajkovaZ,BeverCR,etal.One-stepimmunoassayfortetrabromobisphenolausingacamelidsingledomainantibody-alkalinephosphatasefusionprotein.AnalChem,2015,87:4741-8LinJ,YuJ,WangH,etal.Developmentofahighlythermostableimmunoassaybasedonananobody-alkalinephosphatasefusionproteinforcarcinoembryonicantigendetection.AnalBioanalChem,2020,412:1723-8[35]SunT,ZhaoZ,LiuW,etal.Developmentofsandwichchemiluminescentimmunoassaybasedonananti-staphy-lococcalenterotoxinBnanobody-alkalinephosphatasefusionproteinfordetectionofstaphylococcalenterotoxinB.AnalChimActa,2020,11