第十五章甾體激素類藥物的分析

第一節(jié)基本結(jié)構(gòu)與分類1第二節(jié)理化性質(zhì)與鑒別試驗(yàn)2第三節(jié)特殊雜質(zhì)與檢查

3第四節(jié)含量測(cè)定4第五節(jié)體內(nèi)甾體激素類藥物分析54616ABCD1235789101112131415171819基本結(jié)構(gòu)環(huán)戊烷駢多氫菲甾體激素性激素腎上腺皮質(zhì)激素

雄性激素孕激素雌激素

分類蛋白同化激素

腎上腺皮質(zhì)激素△4–3–酮基C17–醇酮基氫化可的松腎上腺皮質(zhì)激素醋酸地塞米松腎上腺皮質(zhì)激素曲安奈德腎上腺皮質(zhì)激素地塞米松磷酸鈉雄性激素甲睪酮雄性激素丙酸睪酮蛋白同化激素苯丙酸諾龍?jiān)屑に谻17-甲酮基黃體酮孕激素醋酸甲地孕酮雌性激素炔雌醇雌性激素雌二醇此外炔諾酮炔諾孕酮一、基本結(jié)構(gòu)與分類

1.腎上腺皮質(zhì)激素主要活性基團(tuán)性質(zhì)△4–3–酮UV、與羰基試劑反應(yīng)

C17–α–醇酮基還原性2.雄性激素及蛋白同化激素主要活性基團(tuán)性質(zhì)△4–3–酮UV、與羰基試劑反應(yīng)

C17–β–羥基可成酯3.孕激素主要活性基團(tuán)性質(zhì)△4–3–酮UV、與羰基試劑反應(yīng)C17–甲酮基與亞硝基鐵氰化鈉反應(yīng)4.雌性激素主要活性基團(tuán)性質(zhì)A環(huán)為3–OH苯環(huán)UV、與重氮苯磺酸鹽反應(yīng)C17–乙炔基與AgNO3反應(yīng)C17–羥基可成酯二、理化性質(zhì)與鑒別試驗(yàn)（一）理化性質(zhì)

（二）鑒別實(shí)驗(yàn)比旋度：不對(duì)稱物質(zhì)具有旋光性，當(dāng)偏振光透過(guò)1dm，樣品濃度為1g/ml的溶液，在一定波長(zhǎng)和溫度下測(cè)得的旋光度稱為比旋度。（一）理化性質(zhì)吸收系數(shù)：在給定的波長(zhǎng)、溶劑和溫度等條件下，吸光物質(zhì)在單位濃度、單位液層厚度時(shí)的吸光度。反映了藥物的紫外吸收特征（一）理化性質(zhì)（二）鑒別試驗(yàn)薄層色譜法

制備衍生物測(cè)定熔點(diǎn)

高效液相色譜法

紫外分光光度法

紅外分光光度法

化學(xué)鑒別法鑒別試驗(yàn)

（一）化學(xué)鑒別法1.與強(qiáng)酸的呈色反應(yīng)甾體激素類藥物呈色H2SO4

H3PO4HClO4HCl母核的一般鑒別試驗(yàn)藥物顯色熒光加水稀釋醋酸可的松黃或微帶橙X顏色消失溶液澄清炔雌醇橙紅黃綠玫瑰紅色絮狀沉淀炔雌醚橙紅黃綠紅色沉淀潑尼松橙X黃至藍(lán)綠潑尼松龍深紅X紅色消失，有灰色絮狀沉淀

與硫酸顯色反應(yīng)2.官能團(tuán)的反應(yīng)腎上腺皮質(zhì)激素藥物呈色四氮唑鹽OHˉ（1）C17

–

α–醇酮基還原性呈色反應(yīng)此外還有斐林試液、多倫試液四氮唑比色法甾酮類激素藥物腙（黃色）羰基試劑（2）C3–酮基和C20–酮基常用的羰基試劑：2,4-二硝基苯肼、異煙肼、硫酸苯肼具有甲酮基或活潑亞甲基的甾體激素類藥物藍(lán)紫色亞硝基鐵氰化鈉間二硝基酚芳香醛（3）甲酮基黃體酮藍(lán)紫色亞硝基鐵氰化鈉其他甾體淡橙色或不顯色雌激素類藥物紅色偶氮染料重氮苯磺酸（4）酚羥基含炔基的甾體激素銀鹽沉淀硝酸銀（5）炔烴的沉淀反應(yīng)↓有機(jī)氟Fˉ有機(jī)破壞有機(jī)氯Clˉ（6）有機(jī)鹵素茜素氟藍(lán)

硝酸亞鈰硝酸—硝酸銀AgCl↓呈藍(lán)紫色

一般先進(jìn)行水解，生成相應(yīng)的羧酸，再根據(jù)羧酸的性質(zhì)來(lái)進(jìn)行鑒別。（7）酯的反應(yīng)△４-3-酮、苯環(huán)、其他共軛結(jié)構(gòu)（二）UV法1.結(jié)構(gòu)依據(jù)240nm左右280nm左右2.示例曲安息龍丙酸倍氯米松溶劑甲醇乙醇20μg/ml濃度20μg/ml結(jié)果判斷在238nm處有最大吸收在239nm處有最大吸收，A為0.57～0.60，在239nm與263nm處的吸收度比值為2.25～2.45結(jié)構(gòu)特征：酚羥基、C17–OHC17–乙炔基炔雌醇（三）IR法1505cm-1ν3505cm-13300cm-1ν1590cm-13610cm-1酚羥基醇羥基1615cm-1苯環(huán)的骨架振動(dòng)ν結(jié)構(gòu)特征：△４-3-酮、C17-甲酮基黃體酮1700cm-1

C=O20位酮基1665cm-13位酮基1615cm-1870cm-1

C-H雙鍵（四）TLC法

主要用于甾體激素類藥物制劑的鑒別

方法：對(duì)照品法要求供試品溶液所顯主斑點(diǎn)的顏色和位置與對(duì)照品溶液的主斑點(diǎn)相同。（五）HPLC法

主要用于甾體激素類藥物制劑的鑒別（如：醋酸曲安奈德軟膏、醋酸氟輕松軟膏）

方法：對(duì)照品法要求在含量測(cè)定項(xiàng)下記錄的色譜圖中，供試品峰的tR與對(duì)照品峰的tR一致。硒的檢查有關(guān)物質(zhì)的檢查

殘留溶劑的檢查

游離磷酸鹽的檢查

三、特殊雜質(zhì)檢查（一）有關(guān)物質(zhì)的檢查

檢查意義：其他甾體與甾體激素藥物結(jié)構(gòu)相似，也有一定的藥理作用而又互不相同.

檢查方法（具有一定分離能力）

TLC法（高低濃度對(duì)比法）

HPLC法（類似高低濃度對(duì)比法）（1）TLC法（高低濃度對(duì)比法）

判定方法：

規(guī)定雜質(zhì)斑點(diǎn)數(shù)目

規(guī)定雜質(zhì)斑點(diǎn)顏色例：炔孕酮中有關(guān)物質(zhì)的檢查供試液：本品+氯仿-甲醇(3:1)

濃度：10mg/ml對(duì)照液：供試液（10mg/ml）+氯仿-甲醇(3:1)

濃度：50μg/ml層析：供試液點(diǎn)樣、展開(kāi)、斑點(diǎn)檢出。

對(duì)照液判斷：供試液如顯雜質(zhì)斑點(diǎn)，其熒光強(qiáng)度與對(duì)照溶液主斑點(diǎn)比較，不得更深。（2）HPLC法（主成分自身對(duì)照法）

判定方法：

規(guī)定雜質(zhì)峰數(shù)目規(guī)定雜質(zhì)峰面積藥物二氨基萘比色法測(cè)定氧瓶燃燒(二）硒的檢查有毒來(lái)源合成中用二氧化硒(SeO2)脫氫（三）有機(jī)溶劑殘留量的檢查甲醇≤

0.3％丙酮≤5.0%

內(nèi)標(biāo)法+校正因子以地塞米松磷酸鈉為例GC法供試液鉬酸銨1-氨基-2-萘酚-4-磺酸.鉬藍(lán)：740nm對(duì)照液：同法要求：供試品溶液吸光度不得大于對(duì)照溶液吸光度（四）游離磷酸鹽的檢查（對(duì)照液0.0035%KH2PO4）比色法

紫外分光光度法含量測(cè)定高效液相色譜法

四、含量測(cè)定（一）HPLC法USP、BP、JP均采用RP－HPLC（大多內(nèi)標(biāo)法）（甾體激素類藥物常含有結(jié)構(gòu)相似的其他甾體雜質(zhì)，對(duì)利用結(jié)構(gòu)特征設(shè)計(jì)的比色法有干擾）測(cè)定對(duì)象：甾體激素類藥物的原料和制劑示例：地塞米松磷酸鈉的含量測(cè)定

色譜條件：固定相ODS，流動(dòng)相三乙胺溶液-甲醇-乙腈（55:40:5）檢測(cè)波長(zhǎng)242nm系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：n>7000，地塞米松磷酸鈉峰和地塞米松峰分離度應(yīng)大于4.4離子對(duì)液相色譜流動(dòng)相真空脫氣機(jī)四元泵自動(dòng)進(jìn)樣器紫外檢測(cè)器熒光檢測(cè)器蒸發(fā)光散射檢測(cè)器液質(zhì)聯(lián)用儀質(zhì)譜檢測(cè)器流動(dòng)相：對(duì)于以C18為固定相的反相色譜系統(tǒng)，常用甲醇-水，間或加以乙腈、緩沖液等為流動(dòng)相，有機(jī)溶劑比例通常不低于5％四元泵自動(dòng)進(jìn)樣器填充劑常用：十八烷基硅烷鍵合硅膠檢測(cè)器（二）UV法△４-3-酮

240nm（±）腎上腺皮質(zhì)激素雄性激素和蛋白同化激素孕激素苯環(huán)

280nm（±）雌激素1.四氮唑比色法

2.異煙肼比色法

3.

Kober反應(yīng)比色法

（三）比色法

腎上腺皮質(zhì)激素類C17-α－醇酮基強(qiáng)還原性（1）原理1.四氮唑比色法有色甲瓚四氮唑鹽醇酮基-a-17COH-[還原]三苯甲瓚↓深紅氯化三苯四氮唑（TTC）紅四氮唑（RT）[H]藍(lán)四氮唑（BT）525nm（2）方法對(duì)照品法25℃氫氧化四甲基銨對(duì)照液供試液ATTC40～45′暗（3）討論A.基團(tuán)對(duì)反應(yīng)速度的影響C11=O＞C11－OHC21－OH＞C21-酯B.溶劑、水分的影響

以無(wú)醛乙醇為溶劑，水含量大時(shí)，呈色減慢，不超過(guò)5％對(duì)結(jié)果沒(méi)有影響C.O2與光線的影響避光隔絕空氣、快速、充N2D.堿的種類及加入順序以氫氧化四甲基銨的結(jié)果最佳加入順序：皮質(zhì)激素堿試液四氮唑鹽E.溫度與時(shí)間室溫（25℃）反應(yīng)40～45min腎上腺皮質(zhì)激素、雄性激素和蛋白同化激素、孕激素C3－酮基（1）原理異煙腙（黃）酮基異煙肼-3CHCl（縮合）2.異煙肼比色法420nm異煙腙（黃色）（2）方法對(duì)照品法60℃異煙肼無(wú)水甲醇對(duì)照液供試液A暗60′（3）討論反應(yīng)速度（反應(yīng)專屬性）A.C3=O＞C17=O、C20=OC11=O不反應(yīng)反應(yīng)專屬性C3－酮基B.溶劑的選擇異煙肼鹽酸鹽→受溶解度的影響無(wú)水甲醇無(wú)水乙醇對(duì)試劑的穩(wěn)定性好、呈色強(qiáng)度較無(wú)水乙醇中高、但對(duì)植物油的溶解度小C.水分、溫度、O2與光線的影響

含水量↑→腙水解↑→A↓→%↓O2與光線對(duì)反應(yīng)的影響不大t℃↑→ν↑酸:異煙肼=2:1最大吸收度鹽酸濃度0.0074mol/L異煙肼濃度0.00365mol/LD.酸的種類和濃度及異煙肼的濃度(1)原理H2SO4-乙醇加熱H2Oλmax=465加熱雌激素黃色桃紅λmax=5153.Kober反應(yīng)比色法雌二醇-3-甲醚λmax=465nmλmax=515nm鐵－酚試劑[(NH4)2Fe(SO4)2+H2SO4+H2O2+苯酚]*鐵鹽的作用

加快黃色產(chǎn)物的形成、轉(zhuǎn)化加強(qiáng)紅色產(chǎn)物的穩(wěn)定性*酚的作用

加快紅色產(chǎn)物的形成消除反應(yīng)產(chǎn)生的熒光第五節(jié)體內(nèi)甾體激素類藥物分析1藥物代謝研究

2生物利用度研究

3違禁藥物監(jiān)測(cè)

1方法的專屬性強(qiáng)

此類分析的特點(diǎn)：給藥劑量很小

2藥物濃度低3分析方法的靈敏度較高4競(jìng)技運(yùn)動(dòng)員體內(nèi)違禁甾體激素藥物的分析LC-MS測(cè)定法[3]

在線固相微萃取(solid-phasemicroextraction,SPME)技術(shù)[3]HPLC-UV測(cè)定法[4]方法[3]SaitoK,YagiK,IshizakiA,KataokaH.Determinationofanabolicsteroidsinhumanurinebyautomatedin-tubesolid-phasemicroextractioncoupledwithliquidchromatography–massspectrometry.JofPharmaceuticalandBiomedicalAnalysis,2010,52:727–733[4]KoniecznaL,PlenisA,OledzkaI,KowalskiP,B?AczekT.OptimizationofLCmethodforthedeterminationoftestosteroneandpitestosteroneinurinesamplesinviewofiomedicalstudiesandanti-dopingesearchstudies.Talanta,2011,83:804-814對(duì)受試對(duì)象給藥，一定時(shí)間后采集尿樣加內(nèi)標(biāo)物，調(diào)節(jié)PH，加酶進(jìn)行水解一段時(shí)間，離心，取上清液。用上述制的的樣品，進(jìn)行SPME處理，分離純化后經(jīng)LC-MS分析示例1：尿中違禁同化激素的SPME/LC–MS檢查圖：志愿受試者尿樣中睪酮等七種違禁甾體激素藥物的LC-MS測(cè)定

左炔諾孕酮

血漿藥代動(dòng)力學(xué)和生物等效性研究左炔諾孕酮是一種高效的孕激素，作為速效避孕藥，廣泛應(yīng)用于臨床和計(jì)劃生育。有文獻(xiàn)報(bào)道，建立LC-MS/MS法檢測(cè)血漿中左炔諾孕酮的方法，研究左炔諾孕酮分散片在健康自愿受試者體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)和相對(duì)生物利用度，并評(píng)價(jià)生物等效性，為臨床用藥提供依據(jù)[5,6]。

5.Li-ZiZh,Guo-PingZh,Hui-ChangB,LiangD,YingD,SuG,Xiao