農(nóng)業(yè)部2406號(hào)公告一9—2016轉(zhuǎn)基因動(dòng)物及其產(chǎn)品成分檢測定性PCR方法I1定性PCR方法轉(zhuǎn)基因動(dòng)物及其產(chǎn)品成分檢測豬內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因定性PCR方法轉(zhuǎn)基因動(dòng)物及其產(chǎn)品成分檢測羊內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因定性PCR方法hLALBAHomosapiensLactal2農(nóng)業(yè)部2406號(hào)公告—9—20165.51mol/L三羥甲基氨基甲烷一鹽酸溶液(pH8.0):稱取121.1g三羥甲基氨基甲烷(Tris)溶解于800mL水中，用鹽酸(HCl)調(diào)pH至8.0,加水定容至1000mL。在103.4kPa(121℃)條件下滅菌205.6TE緩沖液(pH8.0):分別量取10mL三羥甲基氨基甲烷一鹽酸溶液和2mL乙二銨四乙酸二鈉溶液，加水定容至1000mL。在103.4kPa(121℃)條件下滅菌20min。5.750×TAE緩沖液：稱取242.2g三羥甲基氨基甲烷(Tris),先用500mL水加熱攪拌溶解后，加入100mL乙二銨四乙酸二鈉溶液，用冰乙酸調(diào)pH至8.0,然后加水定容到1000mL。使用時(shí)，用水稀釋5.8加樣緩沖液：稱取250.0mg溴酚藍(lán)，加入10mL水，在室溫下溶解12h;稱取250.0mg二甲基苯腈藍(lán)，加10mL水溶解；稱取50.0g蔗糖，加30mL水溶解?；旌弦陨?種溶液，加水定容至100mL,在4℃下保存。5.9DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；可清楚地區(qū)分1o0bp～10005.10dNTPs混合溶液：將濃度為10mmol/L的dATP、dTTP、GTP、hoTP4種脫氧核糖核苷酸溶液等體積混合。5.11TaqDNA聚合酶。5.13hLALBA基因引物正向引物hLALBA年5'-TGTCAGrgCTGCTGTdc-反向引物hLALBAR:5'-AGTCTTCAAGAATTcccT預(yù)期擴(kuò)增片段大小為156bp(參見附錄A)。5.14內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因引物!根據(jù)樣品來源選擇對(duì)應(yīng)的牛內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因(見農(nóng)業(yè)部2031號(hào)公告—14—2013)、羊內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因(見農(nóng)業(yè)部2122號(hào)公告—2=2014)豬內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因(見農(nóng)業(yè)部2122號(hào)公告—1-2014),確定檢測引物。5.15引物溶液：用TE緩沖液或水分別將引物稀釋到10pmol/L。5.17動(dòng)物基因組DNA提取試劑盒。5.19PCR產(chǎn)物回收試劑盒。6主要儀器和設(shè)備6.2渦旋微型離心機(jī)：最大相對(duì)離心力2000g6.3微量紫外分光光度計(jì)：2ng/μL～15000ng/μL。6.4PCR擴(kuò)增儀：升降溫速度>1.5℃/s,孔間溫度差異<1.0℃。6.5電泳槽、電泳儀等電泳裝置。6.6凝膠成像系統(tǒng)。7分析步驟7.1DNA模板制備7.1.1DNA模板制備采用農(nóng)業(yè)部2406號(hào)公告—7—2016的方法，測定并記錄DNA在260nm和280nm的吸光度。將DNA適當(dāng)稀釋或濃縮，使其OD?o值在0.1~0.8的區(qū)間內(nèi)。以1個(gè)OD?s值相當(dāng)于3農(nóng)業(yè)部2406號(hào)公告—9—201650ng/μLDNA濃度來計(jì)算純化DNA的濃度，并進(jìn)行DNA凝膠電泳檢測DNA完整性。DNA溶液OD?60/OD?so值應(yīng)在1.7～2.0之間，或質(zhì)量能符合檢測要求。7.1.2依據(jù)測得的濃度，將DNA溶液用TE緩沖液稀釋到25ng/μL,-20℃保存。7.2.1.1內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因PCR擴(kuò)增根據(jù)樣品來源選擇合適的牛、羊、豬內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因，確定對(duì)應(yīng)的PCR擴(kuò)增引物、反應(yīng)體系和反應(yīng)程序。7.2.1.2基因特異性序列PCR擴(kuò)增7.2.1.2.1每個(gè)試樣PCR擴(kuò)增設(shè)置3次平行。7.2.1.2.2在PCR擴(kuò)增管中按表1依次加人反應(yīng)試劑，渦旋振蕩混勻，再加25μL石蠟油(有熱蓋功能的PCR儀可不加)。也可采用經(jīng)驗(yàn)證的、等效的定性Per粒增試劑盒配制反應(yīng)體系。終濃度水dNTPs混合溶液各2.nmol/12L0.025U/μL總體積7.2.1.2.4進(jìn)行PQR擴(kuò)增，反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5min;95℃變性30.56℃退火30s,72℃延伸15s,共進(jìn)行35次循環(huán)；72℃延伸5min。7.2.1.2.5反應(yīng)結(jié)束質(zhì)取出PCR管，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測在試樣PCR擴(kuò)增的同時(shí)，應(yīng)設(shè)置陰性對(duì)照、陽性對(duì)照和空白對(duì)照以與試樣相同種類的非轉(zhuǎn)基因動(dòng)物基因組DNA作為陰性對(duì)照；以含有hLALBA基因的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%～1.0%的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物基因組DNA作為陽性對(duì)照；以水作為空白對(duì)照。7.3PCR產(chǎn)物電泳檢測按20g/L的質(zhì)量濃度稱量瓊脂糖，加入1×TAE緩沖液中，加熱溶解，配制成瓊脂糖溶液。每100mL瓊脂糖溶液中加入5μLEB溶液，混勻。稍適冷卻后，將其倒入電泳板上，插上梳板。室溫下凝固成凝膠后，放入1×TAE緩沖液中，垂直向上輕輕拔去梳板。取4μLPCR產(chǎn)物與2μL加樣緩沖液混合后加入凝膠點(diǎn)樣孔，同時(shí)在其中一個(gè)點(diǎn)樣孔中加入DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。接通電源在2V/cm～5V/cm條件下電泳15min～20min,再用凝膠成像系統(tǒng)檢測。7.4凝膠成像分析電泳結(jié)束后，取出瓊脂糖凝膠，置于凝膠成像儀上或紫外透射儀上成像。根據(jù)DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)判斷擴(kuò)增條帶的大小，將電泳結(jié)果形成電子文件存檔或用照相系統(tǒng)拍照。如需通過序列分析確認(rèn)PCR擴(kuò)4農(nóng)業(yè)部2406號(hào)公告—9—20168.1對(duì)照檢測結(jié)果分析增片段大小與預(yù)期片段大小一致，而陰性對(duì)照中僅擴(kuò)增出內(nèi)標(biāo)基因片段，空中檢測出含有人α-乳清蛋白基因成分