關于酶聯(lián)免疫吸附試驗的影響因素

實驗過程中的影響因素終止與讀數(shù)結果的判讀試劑加樣溫育樣本洗板顯色第2頁,共48頁，星期六，2024年，5月

一、標本

排泄物血清唾液尿液、糞便分泌物體液第3頁,共48頁，星期六，2024年，5月血清標本脂血標本溶血標本標本的保存標本的離心采血試管第4頁,共48頁，星期六，2024年，5月

采血試管

1.使用非抗凝標本（血清）；

肝素抗凝血漿會增加OD值;EDTA、酶抑制劑(如NaN3)可抑制ELISA檢測系統(tǒng)中辣根過氧化物酶活性;2.最好使用一次性玻璃試管或真空采血管.第5頁,共48頁，星期六，2024年，5月

標本采集后，應先將標本37°放置30-60分鐘后采用3000r/min離心15-20分鐘，取

上清液加樣。15min3000r/min標本的離心第6頁,共48頁，星期六，2024年，5月

標本的離心

強行離心分離血清，會使血清中仍殘留部分纖維蛋白原，在ELISA測定過程中可以形成肉眼可見的纖維蛋白塊或附著在酶標板孔壁內使酶標記物不易洗掉，易造成假陽（陰）性結果。第7頁,共48頁，星期六，2024年，5月

標本的保存

1.一周----2～4℃保存；2.超過一周----建議-20℃保存。3.冰凍血清融解后，蛋白質會出現(xiàn)局部濃縮而分布不均，加樣前應充分混勻。

第8頁,共48頁，星期六，2024年，5月

標本的保存

4.混濁或有沉淀的血清標本應先離心或

過濾，澄清后再檢測。5.作多次檢測，宜少量分裝冰存;6.血清標本宜在新鮮時檢測盡量避免細

菌污染。第9頁,共48頁，星期六，2024年，5月

避免細菌污染A.如有細菌污染，菌體中可能含有內源性的HRP會產生假陽性；

B.細菌的生長，其所分泌的一些酶可能會對抗原抗體等蛋白產生分解作用（如明膠酶等蛋白水解酶）；

C.一些細菌的內源性酶如大腸桿菌的β-半乳糖苷酶本身會對用相應酶作標記的測定方法產生非特異性干擾。第10頁,共48頁，星期六，2024年，5月

溶血標本

1.ELISA以辣根過氧化物酶標記抗原或

抗體；2.紅細胞破壞后可釋放出大量的具有過

氧化物酶活性的血紅蛋白；3.殘留的過氧化物酶催化底物產生非特

性顯色導致結果假陽性。第11頁,共48頁，星期六，2024年，5月

脂血標本

1.脂質小粒粘附在反應孔內壁；2.非離子型洗滌劑很難洗掉反應板上干

擾性物質的非特異性吸附，引起吸光

度A值升高，易造成假陽性結果。

餐后抽血、高甘油三脂血癥患者、標本離心時間、離心速度不合適等，都可使分離的血清標本中殘留著大量的脂質小粒。第12頁,共48頁，星期六，2024年，5月

二、試劑1.試劑盒保存于2-8℃2.使用前應先將檢測試劑盒放置室溫平衡15-30分鐘，保證酶等液體的初始反應溫度及活性劑的溶解。3.觀察外包裝和內組份有無漏液。第13頁,共48頁，星期六，2024年，5月三、加樣仔細注意加樣全部過程移液器的使用及時放入孵育箱標本較多時，請分批操作試劑的滴加第14頁,共48頁，星期六，2024年，5月

加樣過程應注意：

A.加樣不可太快；B.要避免加在孔壁上部；C.不可濺出；D.避免產生氣泡；E.盡可能使用同一加樣器，裝緊槍頭，加樣后充分混勻。第15頁,共48頁，星期六，2024年，5月

試劑的滴加

從滴瓶中滴加，應注意滴加的角度和速度。滴加太快，很容易出現(xiàn)重復滴加或加在兩孔之間的現(xiàn)象，這樣就會在孔內的非包被區(qū)出現(xiàn)非特異吸附，從而引起非特異顯色。第16頁,共48頁，星期六，2024年，5月第17頁,共48頁，星期六，2024年，5月移液器的使用移液的方法及注意事項槍頭的裝配量程的調節(jié)第18頁,共48頁，星期六，2024年，5月量程的調節(jié)

1.從大體積調為小體積2.從小體積調為大體積

在該過程中，千萬不要將按鈕旋出量程，否則會卡住內部機械裝置而損壞了移液槍第19頁,共48頁，星期六，2024年，5月

槍頭（吸液嘴）的裝配

使勁地在槍頭盒子上敲幾下——錯誤

將移液槍（器）垂直插入槍頭中，稍微用力左右微微轉動即可使其緊密結合——正確槍頭卡緊的標志是略為超過O型環(huán)，并可以看到連接部分形成清晰的密封圈。第20頁,共48頁，星期六，2024年，5月移液的方法前進移液法反向移液法

一般用于轉移高粘液體、生物活性液體、易起泡液體或極微量的液體，其原理就是先吸入多于設置量程的液體，轉移液體的時候不用吹出殘余的液體。重復操作移液法

適用于快速、簡便地重復轉移等量的同種液體。全血移液法第21頁,共48頁，星期六，2024年，5月

移液的注意事項

1.吸取液體時，移液器保持豎直狀態(tài)，將槍頭插入液面下1厘米。

注意吸液體時，一定要緩慢平穩(wěn)的松開拇指，絕不允許突然松開，以防將溶液吸入過快而沖入移液器內腐蝕柱塞而造成漏氣。第22頁,共48頁，星期六，2024年，5月

移液的注意事項

2.設定加樣體積，不能大于加樣槍標定的移液范圍

3.加樣吸嘴的潔凈和裝配

4.吸取液體和排出液體動作都一定要慢。

第23頁,共48頁，星期六，2024年，5月

移液的注意事項

5.加樣槍嚴禁吸取有強揮發(fā)性、強腐蝕性的液體（如濃酸、濃堿、有機物等）

6.不要用大量程的加樣槍移取小體積的液體，以免影響準確度。

第24頁,共48頁，星期六，2024年，5月

移液的注意事項

7.如不使用，要把移液槍的量程調至最大值的刻度，使彈簧處于松弛狀態(tài)以保護彈簧，并將其豎直掛在移液槍架上。8.表面清潔：用10%的次氯酸鈉溶液或70%的酒精溶液清潔后，自然晾干。

9.微量加樣槍必須按要求定期進行校準。第25頁,共48頁，星期六，2024年，5月四、溫育

1.抗原抗體反應必須在一定的溫度條件下反應一定的時間。2.溫育所需時間與溫度成反比。3.最為常用的溫育溫度有37℃和室溫，其次是43℃和2～8℃。

第26頁,共48頁，星期六，2024年，5月

實際操作中應注意：

溫育溫度的選擇足夠的反應時間“邊緣效應”的排除第27頁,共48頁，星期六，2024年，5月

溫育溫度的選擇

1.微孔板從室溫拿至水浴箱或溫箱中時，孔內溫度從室溫升至37℃，需要一定的時間；2.在臨床實驗室中，通常是將微孔板一放入溫箱即開始計時，這樣就很容易造成實際測定中溫育時間不夠，弱陽性樣本測不出來的問題。第28頁,共48頁，星期六，2024年，5月

“邊緣效應”的排除1.“邊緣效應”，即外周孔顯色較中心孔深;2.有研究證實在溫育中的熱力學梯度可能是根本原因。3.聚苯乙烯本身為不良熱導體，板從室（通常在25℃左右）置于37℃溫箱，板升溫時，在外周孔與中心孔之間可能存在一熱力學梯度。第29頁,共48頁，星期六，2024年，5月

總而言之，在臨床ELISA測定中，要保證好的測定效果，應盡量采用水浴。

溫育中讓微孔板浮于水面上（浸入1/3），或將浸透水的沙布放入一大飯盒中形成濕盒，然后放于溫箱中，這樣可使微孔板板孔底部直接與37℃水或濕布接觸，而且水浴箱或濕盒內溫度較高，可使反應溶液的溫度迅速與溫室平衡。第30頁,共48頁，星期六，2024年，5月

五、洗板

血清中殘留的纖維蛋白絲或洗滌液析出的結晶易使洗板機針孔全阻塞或半阻塞，造成未結合標記酶洗脫不徹底，導致“花板”造成假陽性或假陰性。第31頁,共48頁，星期六，2024年，5月第32頁,共48頁，星期六，2024年，5月

洗板的注意事項1.要有適當?shù)慕輹r間（30-60秒）。2.洗板機吸液要徹底，殘余量低于5ul。3.洗液應調至適當?shù)淖⒊隽浚靠讘?50ul-450ul之間，但不要溢出孔外。第33頁,共48頁，星期六，2024年，5月4.洗板次數(shù)應與說明書要求一致，盡量不要私自增加或減少洗板次數(shù)。5.稀釋洗液應使用蒸餾水或去離子水，pH值不宜過酸或過堿，保證配出的洗液pH值為7.4±0.2，水質宜新鮮，長菌或有沉淀不宜使用，且用非金屬容器保存。第34頁,共48頁，星期六，2024年，5月6.由于洗滌液系高濃度磷酸鹽，會形成結晶，配制洗液時應完全溶解。7.稀釋好的洗液4℃下可保存3—5天。8.洗板后，拍干包被板，應垂直扣在備好的干凈吸水紙或毛巾上，且每次拍板應換掉前次拍過的毛巾或吸水紙，避免交叉污染。第35頁,共48頁，星期六，2024年，5月9.操作洗板機過程中要不時觀察洗板

機針孔內洗液的通暢狀況，及時糾

正，洗板機不用時應用去離子水清

洗幾遍后關機。10.每周要進行保養(yǎng)清洗。第36頁,共48頁，星期六，2024年，5月

六、顯色

注意事項：1.檢查底物溶液的有效性；2.試劑顯色時先加A液，后加B液，二者不要顛倒。3.前后加入的間隔時間不超過10分鐘。第37頁,共48頁，星期六，2024年，5月4.若把A液和B液先混合，再加樣顯色，需要求二者等體積混合。5.A、B液應避免接觸污染物。6.不同廠家顯色液不得混用。第38頁,共48頁，星期六，2024年，5月

七、終止和讀數(shù)

肉眼判斷結果時，顯色淺不易觀察，影響結果的準確性，必須使用酶標儀檢測結果，以保證結果一致性。第39頁,共48頁，星期六，2024年，5月

注意事項1、酶標儀的波長是否合適或濾光片是否正確。2、單波長或雙波長比色選擇的問題。

ELISA測定比色時，最好是使用雙波長比色

3、加完終止液后30分鐘內讀取數(shù)據(jù)。4、保證酶標板的底部是清潔干燥的。第40頁,共48頁，星期六，2024年，5月雙波長比色？

雙波長比色測定能排除由微滴板本身、板孔內標本的非特異吸收、指紋、刮痕、灰塵等對特異顯色測定吸光度的影響，一般不必設空白孔。

ELISA測定中單個空白孔的非特異吸收上有一定程度的不確定性；在ELISA測定比色時，最好是使用雙波長比色。

第41頁,共48頁，星期六，2024年，5月八、結果的判讀灰區(qū)的定義

灰區(qū)又稱灰色帶反應。就是把OD值在Cutoff值正負20%這個范圍內的標本稱為灰區(qū)標本。這個范圍稱為灰區(qū)。第42頁,共48頁，星期六，2024年，5月