第第頁水中總大腸桿菌的測定1原理總大腸桿菌群可用多管發(fā)酵法或濾膜法檢測。多管發(fā)酵法的原理是依據(jù)大腸菌群**能發(fā)酵乳糖，產(chǎn)酸產(chǎn)氣以及具備革蘭氏染色陰性，無芽孢，呈桿狀等有關(guān)特性，通過三個步驟進行檢驗，求得水樣中的總大腸菌群數(shù)，試驗結(jié)果以*可能數(shù)（mostprobablenumber），簡稱MPN表示。2儀器2.1高壓蒸汽**器。2.2恒溫培育箱，冰箱。2.3生物顯微鏡，載玻片。2.4酒精燈，鎳鉻絲接種棒。2.5培育皿（直徑100mm），試管（5×150mm），小倒管，吸管（1，5，10ml），燒杯（200，500，2000ml），錐形瓶（500，1000ml），采樣瓶。3培育基及染色劑的制備3.1乳糖蛋白胨培育液：將10g蛋白胨、3g牛肉浸膏、3g乳糖和5g氯化鈉加熱溶于1000mL蒸餾水中，調(diào)整pH為7.2－7.4，再加入1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1mL，充分混勻，分裝于試管（內(nèi)有倒管）中，于121℃高壓**器中**15min，貯存于冷暗處備用。3.2三倍濃縮蛋白胨溶液：按上述乳糖蛋白胨培育液的制備方法制備。除蒸餾水外，各組分用量加添至三倍。3.3品紅亞硫酸鈉培育基3.3.1儲備培育基的制備于2000mL燒杯中，先將20—30g瓊脂加到900mL蒸餾水中，加熱溶解，然后加入3.5g磷酸氫二鉀及10g蛋白胨，混勻，使其溶解，再用蒸餾水補充到1000mL調(diào)整溶液pH至7.2—7.4、趁熱用脫脂棉或絨布過濾，再加10g乳糖，混勻，定量分裝于250或500mL錐形瓶內(nèi)，置于高壓**器中，在121℃**15min，貯存與冷暗處備用。3.3.2平皿培育基的制備將上法制備的儲備培育基加熱溶化。依據(jù)錐形瓶內(nèi)培育基的容量，用**吸管按1：50比例吸取5%堿性品紅乙醇溶液，置于**空試管中；再按1：200比例稱取無水亞硫酸鈉，置于另一**空試管內(nèi)，加**水少許使其溶解，再置于沸水浴中煮沸10min（**）。用**吸管吸取已**的亞硫酸鈉溶液，滴加于堿性品紅乙醇溶液內(nèi)至深紅色再褪至淡紅色為止（不宜加多）。將此混合液全部加入已溶化的儲備培育基內(nèi)，并充分混勻（防止產(chǎn)生氣泡）。立刻將此培育基適量（約15mL）傾入已**的平皿內(nèi)，再冷卻凝固后置于冰箱內(nèi)備用，但保存時間不宜超過2周。如培育基由淡紅色變成深紅色則不能再用。3.4伊紅美藍培育基制備于2000mL燒杯中，先將20g瓊脂加到900mL蒸餾水中，加熱溶解，再加入2g磷酸二氫鉀及10g蛋白胨，混合使之溶解，用蒸餾水補充至1000mL，調(diào)整溶液pH值至7.2—7.4，趁熱用脫脂棉或絨布過濾，加入2%伊紅水溶液（0.4g伊紅溶于20mL水中）20ml和0.5%美藍水溶液（0.065g美藍溶于13mL水中）13ml，再加入10g乳糖，混勻后定量分裝于250或500mL錐形瓶內(nèi)，于121℃高壓**15min，放冷至45℃左右，無菌操作下將此培育基適量傾入已**的空平皿內(nèi)，待冷卻凝固后，置于冰箱內(nèi)備用。3.5革蘭氏染色劑3.5.1結(jié)晶紫染色液：將20mL結(jié)晶紫乙醇飽和溶液（稱取4—8g結(jié)晶紫溶于100mL95%乙醇中）和80mL1%草酸銨溶液混合并過濾。該溶液放置過久會產(chǎn)生沉淀，不能再用。3.5.2助染劑：將1g碘與2g碘化鉀混合后，加入少許蒸餾水，充分振蕩，待完全溶解后，用蒸餾水補充至300mL。此溶液2周內(nèi)有效。當溶液由棕黃色變?yōu)榈S色時應(yīng)棄去。為易于儲備，可將上述碘與碘化鉀溶于30mL蒸餾水中，臨用前再加水稀釋。3.5.3脫色劑：95%乙醇。3.5.4復染劑：將0.25g沙黃加到10mL95%乙醇中待完全溶解后，加90mL蒸餾水。4測定步驟4.1生活飲用水4.1.1初發(fā)酵試驗：在兩個裝有已**的50mL三倍濃縮乳糖蛋白胨培育液的大試管或燒瓶中（內(nèi)有倒管），以無菌操作加入充分混勻的水樣10mL，混勻后置于37℃恒溫箱內(nèi)培育24h。4.1.2平板分別：上述各發(fā)酵管經(jīng)培育24h后，將產(chǎn)酸，產(chǎn)氣及只產(chǎn)酸的發(fā)酵管分別接種于伊紅美藍培育基或品紅亞硫酸鈉培育基上，置于37℃培育箱內(nèi)培育24h，選擇符合下列特征的菌落。a.伊紅美藍培育基上：深紫黑色，具有金屬光澤的菌落；紫黑色，不帶或略帶金屬光澤的菌落：淡紫紅色，中心色較深的菌落。b.品紅亞硫酸鈉培育基上：紫紅色，具有金屬光澤的菌落；深紅色，不帶或略帶金屬光澤的菌落；淡紅色，中心顏色較深的菌落。4.1.3取有上述特特征的群落進行革蘭氏染色a、用已培育18－24h的培育物涂片，涂層要薄。b、將涂片在火焰上加溫固定，待冷卻后滴加結(jié)晶紫溶液，1min后用水洗去。c、滴加助染劑，1min后用水洗去。d、滴加脫色劑，搖動玻片，直至無紫色脫落為止（約20－30s），用水洗去。e、滴加復染劑，1min后用水洗去，晾干、鏡檢，呈紫色者為革蘭氏陽性菌，呈紅色者為陰性菌。4、復發(fā)酵試驗：上述涂片鏡檢的菌落如為革蘭氏陰性無芽孢的桿菌，則選擇該菌落的另一部分接種于裝有一般濃度乳糖蛋白胨培育液的試管中（內(nèi)有倒管），每管可接種分別自同一初發(fā)酵管（瓶）的*典型菌落1－3個，然后置于37℃恒溫箱中培育24h，有產(chǎn)酸、產(chǎn)氣者（不論倒管內(nèi)氣體多少皆作為產(chǎn)氣論），即證明有大腸菌群存在。依據(jù)證明有大腸菌群存在的陽性管（瓶）數(shù)查表2—5“大腸菌群檢數(shù)表”，報告每升水樣中的大腸菌群數(shù)。4.2水源水4.2.1于各裝有5ml三倍濃縮乳糖蛋白胨培育液的5個試管中（內(nèi)有倒管），分別加入10ml水樣；于各裝有10ml乳糖蛋白胨培育液的5個試管中（內(nèi)有倒管），分別加入1ml水樣；再于各裝有10ml乳糖蛋白胨培育液的5個試管中（內(nèi)有倒管），分別加入1ml1：10稀釋的水樣。共計15管，三個稀釋度。將各管充分混勻，置于37℃恒溫箱內(nèi)培育24h。4.2.2平板分別和復發(fā)酵試驗的檢驗步驟同“生活飲用水檢驗方法”。4.2.3依據(jù)證明總大腸菌群存在的陽性管數(shù)，查附表2—6“*可能數(shù)（MPN）表”，即求得每100ml水樣中存在的總大腸菌群數(shù)。我國目前系以1L為報告單位，故MPN值再乘以10，即為1L水樣中的總大腸菌群數(shù)。對污染嚴重的地表水和廢水，初發(fā)酵試驗的接種水樣應(yīng)作1：10、1：100、1：1000或更高倍數(shù)的稀釋，檢驗步驟同“水源水”檢驗方法。假如接種水的水樣量不是10ml、1ml和0.1ml，而是較低或較高的三個濃度的水樣量，也可查表求得MPN指數(shù)，再經(jīng)下面公式換算成每100ml的MPN值。MPN值＝MPN指數(shù)×10（ml）/接種量*大的一管（ml）表2—5大腸菌群檢數(shù)表接種水樣總量300ml（100ml2份，10ml2份）10mL水量的陽性管數(shù)100mL水量的陽性瓶數(shù)0121L水樣中大腸菌群數(shù)1L水樣中大腸菌群數(shù)1L水樣中大腸菌群數(shù)03411138182713273111838414245251830706223692727431208315116193660230104069230表2—6*可能數(shù)（MPN）表（接種5份10ml水樣、5份0.1ml水樣時，不同陽性及陰性情況下100ml水樣中**數(shù)的*可能數(shù)和95％可信限值）顯現(xiàn)陽性份數(shù)每100ml水樣中95％可信限值顯現(xiàn)陽性份數(shù)每100ml水樣中95％可信限值10ml1ml0.1ml**數(shù)的下限上限10ml1ml0.1ml**數(shù)的下限上限管管管*可能數(shù)管管管*可能數(shù)00024212697800120.574302798001020.5743133119302040.51144034129310020.575002377010140.51150134118911040.511502431511011160.51551033119312060.515511461612020050.513512632115020171175204917130210711752170231702119221522942822022092215307925190230123285311103125030081195321403731030111225533180445003101122554013035300311144345411704319032