酶聯(lián)免疫反應(yīng)概述免疫分析：是以抗原抗體相互結(jié)合的免疫反應(yīng)為基礎(chǔ)，研究免疫學(xué)技術(shù)及其在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用。

免疫分析的分類(lèi)根據(jù)分析過(guò)程中是否需要標(biāo)記物可分為兩類(lèi)一、標(biāo)記免疫分析：根據(jù)標(biāo)記物的種類(lèi)可分為1、酶免疫分析2、放射免疫分析3、發(fā)光免疫分析4、熒光免疫分析5、金（銀）免疫標(biāo)記分析二、非標(biāo)記免疫分析：免疫沉淀實(shí)驗(yàn)、免疫濁度分析技術(shù)一、酶免疫分析：是利用酶的高效催化和放大作用與特異性免疫反應(yīng)結(jié)合而建立的一種標(biāo)記免疫技術(shù)。原理：用酶標(biāo)記的抗原（或抗體）用于免疫反應(yīng)，并以相應(yīng)的底物被酶分解的顯色反應(yīng)對(duì)樣品中的抗體（或抗原）進(jìn)行定位的分析和鑒定。

根據(jù)是否需要分離結(jié)合與游離的酶標(biāo)記物可分為可分為非均相(或異相)酶免疫測(cè)定和均相酶免疫測(cè)定兩種方法。均相酶免疫分析法（homogeneousenzymeimmunoassay，HEI）是在檢測(cè)過(guò)程中抗原抗體反應(yīng)后，無(wú)需分離結(jié)合和游離酶標(biāo)記物，直接根據(jù)反應(yīng)前后酶活性的改變進(jìn)行待測(cè)物質(zhì)的測(cè)定的分析方法。

均相酶免疫分析主要有酶擴(kuò)大免疫測(cè)定技術(shù)和克隆酶供體免疫測(cè)定兩種方法。均相酶免測(cè)定的對(duì)象為小分子抗原或半抗原，主要用于藥物測(cè)定?？梢灾苯佑糜谌詣?dòng)生化分析儀測(cè)定。非均相酶免疫分析法（heterogeneousenzymeimmunoassay）常用的酶免疫分析法多為非均相法，又可分為液相酶免疫法和固相酶免疫法兩種，以后者最常用，稱(chēng)為酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA）。ELISA是臨床上最常用的免疫分析方法。需經(jīng)過(guò)結(jié)合的標(biāo)記物和游離的標(biāo)記物的分離才能測(cè)定.分離的方法主要通過(guò)固相載體吸附后清洗未結(jié)合的游離標(biāo)記物。

ELISA既可以測(cè)定抗原，也可以測(cè)定抗體。根據(jù)測(cè)定對(duì)象不同，可采用不同的模式，主要有雙抗夾心法、間接法和競(jìng)爭(zhēng)法等。一、ELISA簡(jiǎn)介二、ELISA原理三、ELISA分類(lèi)四、ELISA相關(guān)試劑五、ELISA影響因素六、ELISA應(yīng)用一、ELISA簡(jiǎn)介1971年瑞典學(xué)者Engvall和Perlmann，荷蘭學(xué)者VanWeeman和Schuurs分別報(bào)道將免疫技術(shù)發(fā)展為檢測(cè)體液中微量物質(zhì)的固相免疫測(cè)定方法，稱(chēng)為酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（Enzyme-LinkedImmunosorbnentAssay，ELISA）。自上世紀(jì)70年代初問(wèn)世以來(lái)，ELISA發(fā)展十分迅速，目前已被廣泛用于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)科學(xué)的許多領(lǐng)域。二、ELISA原理ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性，酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性，又保留酶的活性。在測(cè)定時(shí)，受檢標(biāo)本（測(cè)定其中的抗體或抗原）與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。再加入酶標(biāo)記的抗原或抗體，也通過(guò)反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上。此時(shí)固相上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。YY

①固相的抗原或抗體（免疫吸附劑）

②酶標(biāo)記的抗原或抗體（標(biāo)記物）③酶作用的底物（顯色劑）加樣本微量反應(yīng)孔包被好的抗體振蕩、洗板待測(cè)項(xiàng)目（抗原）加入酶標(biāo)記得抗原VV酶標(biāo)記物輕鏈螯合劑辣根過(guò)氧化物酶重鏈振蕩、洗板V加入底物顯色液HHHHHHHHHHHHHH免疫標(biāo)記技術(shù)放射物標(biāo)記技術(shù)酶標(biāo)技術(shù)免疫熒光技術(shù)其他標(biāo)記技術(shù)酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)酶免疫組化技術(shù)雙抗體夾心法競(jìng)爭(zhēng)法雙抗原夾心法間接法三、ELISA分類(lèi)雙抗體夾心法競(jìng)爭(zhēng)法間接法ELISA基本實(shí)驗(yàn)過(guò)程包被：將已知抗原或抗體通過(guò)物理吸附到固相載體表面，使抗原或抗體固相化抗原抗體反應(yīng)：先后加入被檢標(biāo)本和酶結(jié)合物，使之與固相抗原或抗體發(fā)生免疫反應(yīng)而被結(jié)合固定酶促反應(yīng)：在反應(yīng)體系中加入酶作用的底物，使發(fā)生酶促反應(yīng)而顯色實(shí)驗(yàn)中對(duì)照的設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照陰性對(duì)照空白對(duì)照臨界標(biāo)準(zhǔn)品ELISA試劑（1）已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑）；（2）酶標(biāo)記的抗原或抗體（結(jié)合物）；（3）酶的底物；（4）陰性對(duì)照品和陽(yáng)性對(duì)照品（定性測(cè)定中），參考標(biāo)準(zhǔn)品和控制血清（定量測(cè)定中）；（5）結(jié)合物及標(biāo)本的稀釋液；（6）洗滌液；（7）酶反應(yīng)終止液。固相抗原或抗體1、固相載體的性狀固相載體在ELISA測(cè)定過(guò)程中作為吸附劑和容器，不參與化學(xué)反應(yīng)。ELISA載體的形狀主要有：膜（NC膜、PVDF膜、尼龍膜）、微量滴定板（96孔板）、小珠和小試管，以微量滴定板（96孔板）最為常用。良好的ELISA用96孔板應(yīng)該是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之間、同一板各孔之間性能相近。2、包被用抗原用于包被固相載體的抗原按其來(lái)源不同可分為天然抗原、重組抗原和合成多肽抗原三大類(lèi)。3、包被條件酶標(biāo)記的抗原或抗體（結(jié)合物）1、酶用于ELISA的酶應(yīng)符合以下要求：（1）純度高，催化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率高，專(zhuān)一性強(qiáng)，性質(zhì)穩(wěn)定，來(lái)源豐富，價(jià)格不貴；（2）制備成酶結(jié)合物后仍繼續(xù)保留它的活性部分和催化能力；（3）在受檢標(biāo)本中不存在相同的酶；（4）相應(yīng)底物易于制備和保存，價(jià)格低廉；（5）有色產(chǎn)物易于測(cè)定，光吸收高。常用的酶為辣根過(guò)氧化物（horseradishperoxidase，HRP）和堿性磷酸酶（alkalinephosohatase，AP）。酶的底物1、HRP的底物HRP催化過(guò)氧化物的氧化反應(yīng)，常用的供氫體有鄰苯二胺（OPD）、四甲基聯(lián)苯胺（TMB）和ABTS。TMB經(jīng)HRP作用后共產(chǎn)物顯藍(lán)色，目視對(duì)比鮮明。TMB性質(zhì)較穩(wěn)定，可配成溶液試劑，無(wú)致癌性等優(yōu)點(diǎn)。酶反應(yīng)用HCl或H2SO4

終止后，TMB產(chǎn)物由藍(lán)色呈黃色，可在比色計(jì)中定量，2、AP的底物AP為磷酸酯酶，一般采用對(duì)硝基苯磷酸酯（p‐NPP）作為底物。產(chǎn)物為黃色的對(duì)硝基酚，用NaOH終止酶反應(yīng)后，黃色可穩(wěn)定一時(shí)間。NBT/BCIP，紫色反應(yīng)，水沖洗終止反應(yīng)。

試劑因素標(biāo)本因素實(shí)驗(yàn)原理或操作方法環(huán)境因素五、ELISA影響因素●抗原抗體的純度●標(biāo)準(zhǔn)品定值的準(zhǔn)確性●抗體的親和力、滴度和特異性●標(biāo)記物的比活性或免疫活性

試劑因素

內(nèi)源性物質(zhì)常見(jiàn)的有:類(lèi)風(fēng)濕因子（RF）、嗜異性抗體（Id）、補(bǔ)體、人抗動(dòng)物抗體（HAAA）、藥物及其導(dǎo)致的代謝產(chǎn)物和交叉反應(yīng)物質(zhì)等。外源性物質(zhì)主要為：標(biāo)本溶血、標(biāo)本細(xì)菌污染、標(biāo)本儲(chǔ)存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、標(biāo)本凝集不全和采血管中含有添加劑等。自身免疫產(chǎn)品：膽紅素濃度小于0.05mg/mL的黃疸，血紅蛋白濃度小于5.0mg/mL的溶血和甘油三酯濃度小于25.0mg/mL的脂血對(duì)檢測(cè)結(jié)果沒(méi)有影響。

標(biāo)本因素鉤狀效應(yīng)（HOOK效應(yīng)）及交叉反應(yīng)現(xiàn)象顏色終止條件

ELISA實(shí)驗(yàn)終止劑選用引起的持續(xù)發(fā)展的顏色加深影響了陰性和弱陽(yáng)性樣品及定量檢測(cè)樣品的結(jié)果,特別在大批樣品需較長(zhǎng)時(shí)間進(jìn)行讀數(shù)時(shí),這種潛在的顏色逐漸加深現(xiàn)象成為結(jié)果影響的重要因素。ELISA的洗板過(guò)程

洗液沖力過(guò)大會(huì)造成酶結(jié)合物丟失,本底偏淺,吸光度值偏低,且洗板后殘留液規(guī)定一般不超過(guò)2ul。實(shí)驗(yàn)原理或操作方法通風(fēng)、采光與防塵?？刂茰囟燃皾穸?環(huán)境溫度與濕度隨地理位置不同可有很大差異應(yīng)使用系統(tǒng)空調(diào)進(jìn)行控溫,并要求控制空氣濕度為40%～70%之間消除噪音與電磁干擾。穩(wěn)定水電,實(shí)驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)采用蒸餾水(純水)或經(jīng)軟化處理的自來(lái)水。環(huán)境因素六、ELISA應(yīng)用

飼料中鹽酸克倫特羅的測(cè)定飼料中毒素的測(cè)定（主要包括黃曲霉毒素，簡(jiǎn)曲霉毒素）飼料中有害微生物的快速篩檢（如沙門(mén)氏菌）

甲胺磷殘留分析甲基對(duì)硫磷殘留分析呋喃丹殘留分析ELISA在飼料安全檢測(cè)中的應(yīng)用ELISA用于農(nóng)藥殘留的檢測(cè)河豚毒素

植物毒素如罌粟鹼、嗎啡、藻類(lèi)毒素苯并芘

主要有除草劑與殺蟲(chóng)劑兩大類(lèi)例如殺暝松（FN）、甲氟磷酸異已酶（SOMAN）、草不綠（Alachor

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