第八章

蛋白質(zhì)及氨基酸的測(cè)定第一節(jié)1.蛋白質(zhì)的元素組成(The·C:50-55%N:15-18%O:20-23%·

H:6-8%S:0-4%●微量元

素：

P、Fe、Zn、Cu2、

基本結(jié)構(gòu)單位：氨基酸

3、蛋白質(zhì)的變性作用。概述elements

of

protein)4、

蛋白質(zhì)分

析的

重

要

性·

生物活性測(cè)定·

功能性質(zhì)調(diào)查。

營(yíng)養(yǎng)標(biāo)簽總蛋白質(zhì)含量氨基酸組成蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值凱氏定氮法杜馬斯法福林酚法染色法5、

蛋白質(zhì)

的

測(cè)

定

方

法利用特定氨基酸殘基法利用蛋白質(zhì)共性的方法第二節(jié)

蛋白質(zhì)的定性測(cè)定一

、蛋白質(zhì)的一般顯色反應(yīng)電泳或紙層析之后用一些染料與蛋白質(zhì)結(jié)合并變色。書(shū)中列舉了5種染料。二

、復(fù)合蛋白質(zhì)的顯色反應(yīng)(

一)糖蛋白的顯色(3種方法)(二)脂蛋白的顯色(2種方法)蛋白質(zhì)的測(cè)定方法。1

凱

氏

定

氮

法(1833年Kieldahl,常量法、微量法、自動(dòng)定氮儀、半微量法。改良凱氏定氮法)·

2雙縮脲法·

3福林酚(Lowry)法·4Bicinchoninic

Acid

法·

5280nm

紫外吸收法·

6染色法

6.1陰離子染色法7

茚三

酮法。8比濁法·

9杜馬斯法(燃燒法)·

10紅外光譜法··6.2布蘭德福特

(Bradford)

法一

、凱氏定氮法(常量)凱氏定氮法通過(guò)測(cè)出樣品中的總含氮量再乘以

相應(yīng)的蛋白質(zhì)系數(shù)而求出蛋白質(zhì)含量的，由于樣

品中常含有少量非蛋白質(zhì)含氮化合物，故此法的

結(jié)果稱為粗蛋白含量。此外，雙縮脲法、染料結(jié)合法、酚試劑法等

也常用于蛋白質(zhì)含量測(cè)定，由于方法簡(jiǎn)便快速，故多用于生產(chǎn)單位質(zhì)量控制分析。原理o樣

品與濃硫

酸

(

氧

化

、

脫

水)和

催

化

劑

(硫酸銅)一

同加熱

消

化

，

使

蛋

白

質(zhì)分解，其中C,H

氧化為COz

和H?O,

有機(jī)N轉(zhuǎn)化為氨與硫酸結(jié)合成硫酸銨。

加堿蒸餾時(shí)氨蒸出，用硼酸吸收后，再以標(biāo)準(zhǔn)鹽酸或硫酸溶液滴定。。樣品制備·消化。中和、蒸餾·

滴定·

計(jì)算利用換算系數(shù)可以把氮的百分含量轉(zhuǎn)化成樣

品粗蛋白質(zhì)含量。由于大部分蛋白質(zhì)含有16%

的氮，所以其換

算

系

數(shù)一般為6.25(100/16=6.25)。即：%N×6.25=%蛋白質(zhì)蛋

白

質(zhì)

含

量換算系數(shù)蛋或肉16.06.25牛

奶15.76.38小

麥18.765.33玉

米17.705.56燕

麥18.665.36大

豆18.125.52大

米19.345.17部

分

食

品

的

蛋

白

質(zhì)

換

算

系

數(shù)在

消化反應(yīng)中，為了加速蛋白質(zhì)的分解，

縮短消化時(shí)間，常加入下列物質(zhì)1)

硫酸鉀：提高溶液的沸點(diǎn)，加快有機(jī)物分解。它與硫酸作用生

成硫酸氫鉀可提高反應(yīng)溫度，

一般純硫酸的沸點(diǎn)在340℃左右，而添加硫酸鉀后，可使溫度提高至400℃以

上，原因主要在于隨著消化過(guò)程中硫酸不斷地被分解，

水分不斷逸出而使硫酸鉀濃度增大，故沸點(diǎn)升高，其反

應(yīng)式如下：K?SO?+H?SO?→2KHSO?2KHSO?→K?SO?+H?O↑+SO?。硫酸鉀加入量不能太大，否則消化體系

溫度過(guò)高，又會(huì)引起引起生成的銨鹽發(fā)

生熱分解放出氨而造成損失。。除硫酸鉀外，也可以加入硫酸鈉、氯化

鉀等鹽類來(lái)提高沸點(diǎn)，但效果不如硫酸鉀

。(2)

(催化劑、指示劑)硫酸銅起催化劑的作用。使用時(shí)常加入少量過(guò)氧

化

氫，次氯酸鉀等作為氧化劑以加速有機(jī)

物氧化。指示消化終點(diǎn)的到達(dá)，為清澈的藍(lán)綠色。指示蒸餾時(shí)的堿加入量是否足夠。除硫酸銅外，還有氧化汞，汞、硒粉，二氧化鈦等也可用的催化劑。電爐吸收液b.蒸餾吸收裝置常量凱氏定氮消化、蒸餾裝置冷凝管凱氏燒瓶裝置玻璃珠蒸餾燒邦電爐a.情化裝置圖9一

1進(jìn)樣漏平鐵支架鐵支架操作步驟消化準(zhǔn)確稱取固體樣品0.2～2g

(半固體樣品2～5g,液體樣品10～20ml)→移入凱氏燒瓶

→

加入研細(xì)

的硫酸銅0.5g、

硫酸鉀10g和濃硫酸20ml→搖勻

→

安裝消化裝置

→

于凱氏瓶口放一漏斗

→

以45°角

斜支于有小孔的石棉網(wǎng)上

→

用電爐先以小火加熱至內(nèi)容物全部炭化，泡沫停止后

→

加大火力保持瓶?jī)?nèi)液體微沸

→

至液體變藍(lán)綠色透明

→

繼續(xù)加熱

微沸30分鐘

→

冷卻

→

定容。加入玻璃珠數(shù)粒以防蒸餾時(shí)暴沸。蒸餾吸取5mL稀釋后的消化液

→

加入凱氏定

氮儀內(nèi)

→

加10mL40%

的氫氧化鈉

→

夾好漏斗

夾

→

冷凝管下端插入吸收瓶液面下(瓶?jī)?nèi)預(yù)

先裝入10ml4%硼酸溶液及混合指示劑)

→

加熱蒸餾至氨全部蒸出(由紅變藍(lán)后約10分

鐘)

→

將冷凝管下端提離液面

→

用蒸餾水

沖洗管口

→

繼續(xù)蒸餾1分鐘

→

加熱。滴定將上述吸收液用0.1000

mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶

液直接滴定至由藍(lán)色變?yōu)槲?/p>

紅

色(用甲基

紅一溴甲酚綠混合指示劑)即為終點(diǎn)，同

時(shí)作一試劑空白。計(jì)算o

Page

158公式。當(dāng)樣品消化液不易澄清透明時(shí)，可將凱氏燒瓶冷卻，加入30%過(guò)氧化氫2～3ml后再繼續(xù)消化。·一般消化至呈透明后，繼續(xù)消化30分鐘即可，但對(duì)于含有特別難以氨化的氮化合物的樣品，

如含賴氨酸、組氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨

酸等時(shí)，需適當(dāng)延長(zhǎng)消化時(shí)間。有機(jī)物如分解

完全，消化液呈藍(lán)色或淺綠色，但含鐵量多時(shí)，

呈較深綠色。。蒸餾裝置不能漏氣。。蒸餾前若加堿量不足，消化液呈藍(lán)色不生成氫氧化銅沉淀，此時(shí)需再增加氫氧化鈉用量。。硼酸吸收液的溫度不應(yīng)超過(guò)40℃,否則對(duì)氨的吸收作用減弱而造成損失，此時(shí)可置于冷水浴中使用。。蒸餾完畢后，應(yīng)先將冷凝管下端提離液面，

清洗管口，再蒸1分鐘后關(guān)掉熱源，否則可

能造成吸收液倒吸。二

、自動(dòng)凱氏定氮法將凱氏定氮裝置組裝成具有自動(dòng)操作功能的一套裝置，原理與試劑同前。自動(dòng)凱氏定氮儀

：該裝置內(nèi)具有

自動(dòng)加堿蒸餾裝置，自動(dòng)吸收和滴定裝置以及自動(dòng)數(shù)字顯示裝置。消化裝置：由優(yōu)質(zhì)玻璃制成的凱氏消化瓶及紅外線加熱裝置組合而成的消化爐。方法特點(diǎn)及應(yīng)用范圍·靈敏·

準(zhǔn)確·快速·樣品用量少三

、微量凱氏定氮法·原理及適用范圍同常量凱氏定氮法。主要儀器：凱氏燒瓶(100mL);

微量凱氏定氮儀·試劑：0.01000mol/LHCl

標(biāo)準(zhǔn)液，其余同常

量法·Page

160蛋白質(zhì)的快速測(cè)定一雙縮脲法·

原理方法特點(diǎn)及應(yīng)用范圍·靈敏度較低，但操作簡(jiǎn)單快速，在生物化

學(xué)領(lǐng)域中測(cè)定蛋白質(zhì)含量時(shí)常用此法?！みm用于豆類、油料、米谷等作物種子及肉

類等樣品的測(cè)定。也可定量測(cè)定分離純化

后的蛋白質(zhì)。步驟。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：以采用凱氏定氮法測(cè)出蛋白

質(zhì)含量的樣品作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)樣。按蛋白質(zhì)含

量40mg

、50mg

、60mg

、70mg

、80mg

、90mg、100mg、110mg

分別稱取混合均勻的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)

樣于8支50ml納氏比色管中，然后各加入1ml四

氯化碳，再用堿性硫酸銅溶液(①或②)準(zhǔn)確

稀釋至50ml,振搖10分鐘，靜置1小時(shí)，取上

層清夜離心5分鐘，取離心分離后的透明液于

比色皿中，在560nm波長(zhǎng)下以蒸餾水作參比液

調(diào)節(jié)儀器零點(diǎn)并測(cè)定各溶液的吸光度A,

以蛋

白質(zhì)的含量為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)繪制

標(biāo)準(zhǔn)曲線。。樣品的測(cè)定：準(zhǔn)確稱取用品適量(使得蛋

白質(zhì)含量在40～110mg之間)于50mL納氏比

色管中，加1ml四氯化碳，按上述步驟顯色

后，在相同條件下測(cè)其吸光度A。用

測(cè)

得

的

A值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上即可查得蛋白質(zhì)mg數(shù)，進(jìn)

而由此求得蛋白質(zhì)含量。優(yōu)

點(diǎn)

：·

該方法比凱氏定氮法費(fèi)用低，速度快(可在不到

30min

的時(shí)間內(nèi)完成),是分析蛋白質(zhì)最簡(jiǎn)單的方法?！け雀Ａ址臃?、紫外吸收法或比濁法更少發(fā)生顏色

偏離?！缀鯖](méi)有物質(zhì)干擾食品中蛋白質(zhì)的雙縮脲反應(yīng)。不包含非多肽或非蛋白質(zhì)來(lái)源的氮。缺點(diǎn)：。不如福林酚法靈敏，分析時(shí)至少需要2~4mg

蛋

白質(zhì)。。如果存在膽汁素，則吸光度會(huì)虛假增加。。高濃度的胺鹽會(huì)干擾反應(yīng)?！?/p>

不同蛋白質(zhì)其最終反應(yīng)產(chǎn)物的顏色不同，例如

明膠的雙縮脲反應(yīng)產(chǎn)生紅紫色。。如果有高濃度的脂(用醚抽出)或碳水化合物

存在時(shí)，最終的反應(yīng)溶液中可能會(huì)呈乳白色。。

此方法不是一個(gè)測(cè)量絕對(duì)值的方法，必須用已

知濃度的蛋白質(zhì)(如BSA)

或經(jīng)凱氏定氮法校正

。三、福

林

酚(Lowry)

法原

理。蛋白質(zhì)與福林酚試劑反應(yīng)，生成的藍(lán)色復(fù)合物。其中蛋白質(zhì)中的肽鍵與堿性銅離子反應(yīng)形成雙縮

脲反應(yīng)，同時(shí)蛋白質(zhì)中存在的酪氨酸和色氨酸同磷鉬酸-磷鎢酸試劑反應(yīng)產(chǎn)生顏色，蛋白質(zhì)濃度與吸光度有較好的線性關(guān)系。優(yōu)點(diǎn)·

因?yàn)楦Ａ址臃ê?jiǎn)單、靈敏，

已被廣泛應(yīng)用于蛋

化。

，白

不用于測(cè)定未1.

非常靈敏：A:較雙縮脲法靈敏50~100倍。B:

較280nm

紫外吸收法靈敏10~20倍。C:較茚三酮法靈敏好幾倍。D:

與奈斯勒方法的靈敏度相似，但操作比其方便。2.測(cè)定結(jié)果較少受到樣品混濁度的影響。3.

特

異

性要高于其他大多數(shù)方法。4.

操作相對(duì)簡(jiǎn)單，可以在1~1.5小時(shí)內(nèi)完成。質(zhì)一缺點(diǎn)·由于下列因素，福林酚法在某些應(yīng)用中需采用標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)

行校正。1.

反應(yīng)產(chǎn)生的顏色比雙縮脲法更易因蛋白質(zhì)的種類不同而發(fā)生變化。2.

反應(yīng)最終的顏色深淺并不直接與蛋白質(zhì)濃度成正比。3.

蔗糖、脂類、磷酸鹽緩沖液、單糖和己胺會(huì)不同程度

的

干擾反應(yīng)。4.高濃度的還原糖、硫酸銨和巰基化合物會(huì)干擾反應(yīng)。四、

紫

外吸

收

法原理。蛋白質(zhì)在UV280nm

處有強(qiáng)烈吸收，這是由于蛋白質(zhì)中有色氨酸和酪氨酸等芳香環(huán)殘基存在。由于存在于每一種食品的蛋白質(zhì)中

色氨酸和酪氨酸的含量相當(dāng)恒定，所以可

用比色法，即在280nm處比色測(cè)定蛋白質(zhì)的濃度。適用范圍應(yīng)用·簡(jiǎn)便迅速，常用于生物化學(xué)研究工作，但由于許多非蛋白成分在紫外光區(qū)也有吸收作用，故還沒(méi)

有廣泛應(yīng)用于食品體系。。已經(jīng)用于測(cè)定牛奶和肉制品中蛋白質(zhì)的含量，但

此法更適用于純化的蛋白質(zhì)體系，已經(jīng)抽提在堿液或變性劑(如8M尿素)中的蛋白質(zhì)測(cè)定。盡管蛋白質(zhì)中的肽鍵在190nm~220nm

處的紫外吸收比

在280nm

更強(qiáng)，但在低紫外區(qū)域的測(cè)定更困難。優(yōu)點(diǎn)·

快速，相對(duì)較靈敏(在280mm

處需要100ug或更多的蛋白質(zhì)，比雙縮脲法靈敏數(shù)倍)?！し磻?yīng)不受硫酸銨和其它緩沖液的干擾?！?/p>

不破壞樣品原有的性質(zhì)，在測(cè)定完蛋自

質(zhì)含

量

后

仍

然

可

用

于

其

它

分

析

。

廣

泛

用

于

層析柱分離后的蛋白質(zhì)測(cè)定。缺點(diǎn)·核酸在280nm

處也有紫外吸收，純蛋白質(zhì)和純核酸的280nm/260n

m紫外吸收比分別為1.75和

0.5。如果知道280nm/260nm

的值，就能校正核

酸在280nm

處的吸收值。。

不同種類食品的蛋白質(zhì)中，芳香族氨基酸的含

量明顯不同。。樣品溶液必須純凈無(wú)色。。此法適用于相對(duì)純凈的體系。BicinchoninicAcid(BCA)法·

原理Smith

等人提出，在堿性條件下蛋白質(zhì)

將銅離子還原成亞銅離子，亞銅離子一蛋白質(zhì)復(fù)合物和蘋(píng)果綠的BCA試劑反應(yīng)形成淺紫色。反應(yīng)形成顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成

正

比

。BicinchoninicAcid(BCA)法·方法。1

.

蛋白質(zhì)

溶

液

和

含

有BCA

鈉

鹽

、Na,CO?、·

NaOH

、CuSO?

、

pH11.25

的BCA

試劑一步混合。。3

.

在562nm

處比色讀數(shù)，并做空白比較。

。4.用BSA作標(biāo)準(zhǔn)曲線。2.在37℃保溫30min

或室溫下放置2hr,或60℃保溫

30min

。

溫度的選擇取決于靈敏度的要求。較高的溫度導(dǎo)致較深的顏色反應(yīng)。BicinchoninicAcid(BCA)法·

優(yōu)點(diǎn)○

BCA

法已經(jīng)應(yīng)用于蛋白質(zhì)的分離和純化中。此法對(duì)測(cè)定復(fù)雜食品體系中蛋白質(zhì)的適用性還未見(jiàn)報(bào)道?！?/p>

1

.

靈

敏

度

與

福

林

酚

法

相

似

。

微

量BCA

法

的

靈

敏

度(0.5~10ug)

稍高于福林酚法。·

2.

一

步混合的操作比福林酚法更簡(jiǎn)單。。

3.所用試劑比福林酚法簡(jiǎn)單。·4.非離子型表面活性劑和緩沖液不對(duì)反應(yīng)產(chǎn)生干擾。。5

.

中等濃度的變性劑(4M鹽酸胍或3M尿素)不對(duì)反應(yīng)產(chǎn)生干擾。BicinchoninicAcid(BCA)法·

缺

點(diǎn)

：·1.反應(yīng)產(chǎn)生的顏色不穩(wěn)定，需要仔細(xì)地控制比色時(shí)間。

·2.還原糖會(huì)對(duì)此反應(yīng)產(chǎn)生的干擾比對(duì)福林酚法更大?！?.不同蛋白質(zhì)反應(yīng)引起的顏色變化與福林酚法相似。

·4.比色的吸光度與蛋白質(zhì)濃度不成線性關(guān)系。陰離子染色法原理。含蛋白質(zhì)的樣品溶于緩沖液中和已知的過(guò)量陰離子

染

色

劑

混

和

，蛋白質(zhì)與染色劑形成不溶性復(fù)合物。反應(yīng)平衡后，離心或過(guò)濾除去不溶性的復(fù)合

物，再測(cè)定溶液中未結(jié)合的可溶性染色劑?！?/p>

蛋白質(zhì)+過(guò)量染色劑

蛋白質(zhì)-染色劑復(fù)合不

溶物+未結(jié)合可溶性染色劑。陰離子磺酸基染色劑，包括酸性十二號(hào)橙，橙G和

酰黑10B,

都可以和基本氨基酸殘基中的陽(yáng)性基團(tuán)

(組氨酸中的咪唑基、精氨酸中的胍基和賴氨酸中的

e-氨基等),以及蛋白質(zhì)中游離的氨基酸終

端基團(tuán)結(jié)合。。未結(jié)合的染色劑與樣品中蛋白質(zhì)的含量成反比，可用分光光度計(jì)法測(cè)定。方法。1

.

樣品粉碎(60目或更小),加入過(guò)量的染色劑?！?.劇烈搖晃內(nèi)容物加速染色反應(yīng)至平衡，過(guò)濾或離心去除不溶物。·

3

.

測(cè)定濾液中未結(jié)合染色劑溶液的吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線

中計(jì)算染色劑濃度。·

4

.

通過(guò)對(duì)未結(jié)合染色劑濃度與樣品的蛋白質(zhì)總氮含量作

圖，得到一條線性的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

5.

與樣品同類的未知樣品的蛋白質(zhì)含量可以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲

線計(jì)算，或通過(guò)最小二乘法得到的回歸方程計(jì)算。應(yīng)用·陰離子染色法已經(jīng)用來(lái)測(cè)定牛奶及乳制品、小

麥面粉、大豆制品和肉制品中的蛋白質(zhì)?！?/p>

AOAC中共有二種染色方法(使用酸性12號(hào)橙的方法967.12和使用酰胺黑10B

的方法975.17)分析牛奶中的蛋白質(zhì)。優(yōu)點(diǎn)·

快速(10min

或更短),費(fèi)用便宜，結(jié)果相對(duì)比較

準(zhǔn)確?！ひ?yàn)槿旧珓┎慌c不可利用的賴氨酸結(jié)合，因此可

用于測(cè)定谷物產(chǎn)品在加工過(guò)程可利用賴氨酸的含

量，

(

而賴氨酸是谷物產(chǎn)品中的限制氨基酸，所

以可利用賴氨酸含量代表谷物產(chǎn)品的蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)

價(jià)值。)不用腐蝕性試劑。。不需測(cè)定非蛋白氮。缺點(diǎn)o靈敏度低，需要毫克級(jí)的蛋白質(zhì)。。蛋白質(zhì)因基本氨基酸不同而具有不同的染

色容量，

因此，對(duì)于待測(cè)食品需要制作標(biāo)

準(zhǔn)曲線。。因一些非蛋白組份結(jié)合染色劑(如淀粉)

或蛋白質(zhì)(如鈣或磷)而造成最后結(jié)果的

偏差。鈣和重金屬離子引起的問(wèn)題可用含

有草酸的緩沖試劑來(lái)解決?？捡R斯亮蘭染料比色法原理—

當(dāng)考馬斯亮蘭G-250

與蛋白質(zhì)相結(jié)合時(shí)，染

色劑會(huì)從紅色變成藍(lán)色，其最大吸收波長(zhǎng)從465nm

變化至620nm,在620nm

處的吸光度與樣

品中蛋白質(zhì)的濃度成正比。方法·

將考馬斯亮蘭G-250

溶解于95%酒精中，并

用85%磷酸酸化。。含有蛋白質(zhì)(1~100ug/ml)

的樣品和標(biāo)準(zhǔn)BSA溶液分別與Bradford試劑混合。

·

在595nm

處讀取吸光度并扣空白。樣品中的蛋白質(zhì)濃度可通過(guò)BSA

的標(biāo)準(zhǔn)曲線

來(lái)計(jì)算。應(yīng)用。已經(jīng)成功用于測(cè)定麥芽汁、啤酒產(chǎn)品和馬鈴薯塊莖中的蛋白質(zhì)含量。此方法可改善測(cè)定微量蛋白質(zhì)的結(jié)果。該法快速、靈敏，

且比福林酚法較少受其他因素干擾，已廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)純化過(guò)程中的含量測(cè)定。優(yōu)點(diǎn)·

快速，反應(yīng)可在2min內(nèi)完成?！?/p>

重現(xiàn)性好?！れ`敏度高。·不受陽(yáng)離子如K+、Na+

和Mg+

等的干擾?！げ皇芰蛩徜@干擾。。不受多酚和碳水化合物干擾，如蔗糖等。。

可測(cè)定分子量大約等于或高于4000道爾頓的蛋白質(zhì)。缺點(diǎn)·受非離子和離子型去垢劑的干擾，如三硝基甲苯

和十二烷基硫酸鈉。而由于少量的(0.

1%)去垢

劑的存在而導(dǎo)致的結(jié)果偏差可用適當(dāng)?shù)目刂苼?lái)校

正

。。蛋白質(zhì)-染色劑的復(fù)合物可與石英比色皿結(jié)合，分析人員必須使用玻璃比色。反應(yīng)顏色隨不同種類的蛋白質(zhì)而變化，因此，必須仔細(xì)地選擇作為標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)。比濁法·

原理·

低濃度(3~10%)的三氯乙酸、磺基水楊酸和乙

酸中的鐵氰化鉀能使提取的蛋白質(zhì)沉淀形成蛋白

質(zhì)顆粒的懸濁液。其濁度可由輻射光傳送過(guò)程中

的衰減而確定，輻射光傳送過(guò)程中的衰減是由于

蛋白質(zhì)顆粒的散射造成的，輻射光衰減的程度與溶液中的蛋白質(zhì)濃度成正比。比濁法·方法測(cè)定小麥蛋白質(zhì)的常規(guī)方法為磺基水楊酸法

，

具體方法如下所述：·

1.小麥面粉用0.05N氫氧化鈉溶液萃取?！?/p>

2.溶

于

堿

液

的

蛋

白

質(zhì)

從

不

溶

性

原

料

中

離

心分離。Q3.

磺基水楊酸和蛋白質(zhì)溶液混合。·

4

.

在

5

4

0nm處測(cè)定其濁度，并扣去空白。5.蛋白質(zhì)的含量可根據(jù)經(jīng)凱氏定氮法校正過(guò)的標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)計(jì)算。比濁法·

應(yīng)

用。

比濁法已經(jīng)用于測(cè)定小麥面粉和玉米的蛋白

質(zhì)

含

量

?！?/p>

優(yōu)點(diǎn)：。1

.

快速，可在15min內(nèi)完成?！?.測(cè)定結(jié)果不包括除了核酸外的非蛋白氮。缺點(diǎn)：。1.不同的蛋白質(zhì)沉淀的速率不同?！?.濁度隨酸試劑濃度的不同而變化。

·

3.核酸也能被酸試劑沉淀。杜

馬

斯

法

(

燃

燒

法

)·

原理●樣品在高溫下(700~800℃)燃燒，釋放

的氮?dú)庥蓭釋?dǎo)檢測(cè)器(TCD)

的氣相色

譜儀測(cè)定。測(cè)得的氮含量轉(zhuǎn)換成樣品中的

蛋白質(zhì)含量。杜

馬

斯

法

(

燃

燒

法

)·方法·

樣品(大約100~500mg)稱量后置于樣

品盒中，放入具有自動(dòng)裝置的燃燒反應(yīng)器

中，釋放的氮?dú)庥蓛?nèi)置的氣相色譜儀測(cè)定。杜

馬

斯

法

(

燃

燒

法

)·

應(yīng)

用·

燃燒法適用于所有種類的食品，

AOAC

方法992.15和992.23分別用于肉類和谷物食品?！?/p>

優(yōu)點(diǎn)：o

1.

燃燒法是凱氏定氮法的一個(gè)替代方法?！?.不需要任何有害化合物?！?/p>

3

.

可

在

3min

內(nèi)完成?！?.最先進(jìn)的自動(dòng)化儀器可在無(wú)人看管狀態(tài)下分析多達(dá)150個(gè)樣品?！?/p>

缺點(diǎn)：。1

.

需要的儀器價(jià)格昂貴。·

2

.

非蛋白氮也包括在內(nèi)。紅外光譜法原理·

紅外光譜法測(cè)定由食品或其他物質(zhì)中分子引

起的輻射吸收(近紅外，中紅外，遠(yuǎn)紅外區(qū))。食品中不同的功能基團(tuán)吸收不同頻率的輻射。對(duì)于蛋白質(zhì)和多肽，多肽鍵在中紅外波段(6.47um)

和近紅外(NIR)波

段(

如3300~3500nm,2080～2220nm,1560～1670nm)

的特征吸收可用于測(cè)定食品中的蛋白質(zhì)含量。針對(duì)

所要測(cè)的成份，用紅外波長(zhǎng)光輻射樣品，通過(guò)

測(cè)定樣品反射或透射光的能量(反比于能量的吸收)可以預(yù)測(cè)其成份的濃度。紅外光譜法·

應(yīng)用·紅外牛奶分析儀采用中紅外光譜法測(cè)

定牛奶蛋白質(zhì)含量，同時(shí)近紅外光譜儀

也廣泛應(yīng)用于食品蛋白質(zhì)的分析中(如谷物、谷類制品、

肉類和乳制品中)。

這些儀器非常昂貴，且必須經(jīng)適當(dāng)?shù)恼{(diào)試。

但分析人員只需經(jīng)最低程度的培訓(xùn)就可

以快速分析樣品(30sec~2min)。氨

基

酸

的

測(cè)

定

方

法一、茚三酮比色法原理氨基酸(酰氨鍵)在堿性溶液中能與茚三酮作用，

生成藍(lán)紫色化合物(除脯氨酸外均有此反應(yīng))

,可用吸光光度法測(cè)定。該藍(lán)紫色化合物的顏色深淺與氨基酸含量成正比，

其最大吸收波長(zhǎng)為570nm,故據(jù)可以測(cè)定樣品中氨

基酸含量。應(yīng)用。常用來(lái)定性測(cè)定食品中蛋白質(zhì)和氨基酸的存在。·茚三酮法還沒(méi)有廣泛應(yīng)用于食品中蛋白質(zhì)的定量，

然而可用來(lái)測(cè)定食品加工中多肽鍵的水解和氨基酸的定量。。比較快速，但準(zhǔn)確性較低，反應(yīng)生成的顏色隨不

同的氨基酸化合物而變化。標(biāo)準(zhǔn)曲線必須針對(duì)每一個(gè)具體情況而準(zhǔn)備。二、甲醛滴定法原理。氨基酸具有酸性的-COOI

基和堿性的-NII,基。它們相互作用而使氨基酸成為中性的內(nèi)鹽。當(dāng)加

入甲醛溶液時(shí)，

-NII,基與甲醛結(jié)合，從而使其堿

性消失。這樣就可以用強(qiáng)堿標(biāo)準(zhǔn)溶液來(lái)滴定-COOH

基，并用間接的方法測(cè)定氨基酸總量。方法特點(diǎn)及應(yīng)用·此法簡(jiǎn)單易行、快速方便。。在發(fā)酵工業(yè)中常用此法測(cè)定發(fā)酵液中氨基氮含量的變化，以了解可被微生物利用的氮源的量及利

用情況，并以此作為控制發(fā)酵生產(chǎn)的指標(biāo)之一。·脯氨酸與甲醛作用時(shí)產(chǎn)生不穩(wěn)定的化合物，使結(jié)

果偏低；酪氨酸含有酚羧基，滴定時(shí)也會(huì)消耗一

些堿而致使結(jié)果偏高；溶液中若有銨存在也可與

甲醛反應(yīng)，往往使結(jié)果偏高。操作方法·吸取含氨基酸約20mg的樣品溶液于100ml容量瓶中，

加水至標(biāo)線，混勻后吸取20.0ml置于200ml燒杯中，

加水60ml,開(kāi)動(dòng)磁力攪拌器，用0.05mol/1

氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至酸度計(jì)指示pH8.2,

記錄消耗氫·

(勻),。

鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液繼續(xù)滴定至pH9.2,

記錄消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液體積(V??)。化。氧量氫含再用上述供計(jì)算總混V1o液，數(shù)ml甲醛溶準(zhǔn)溶液ml10鈉入化加氧。同時(shí)取80ml蒸餾水置于另一200ml潔凈燒瓶中，先

用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液調(diào)至PH8.2,

(此時(shí)不計(jì)堿消

耗量),再加入10

.

0ml中性甲醛溶液，用0.05mol/1氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至pH9.2,

作為

試劑空白試驗(yàn)。式

中

：V?(V??-V?o)——樣品稀釋液在加入甲醛后滴定至終點(diǎn)

(PH9.2)

所消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，ml

;V?——

空白試驗(yàn)加入甲醛后滴定至終點(diǎn)所消耗的氫氧

化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，

ml;c——

氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，

mol/1;m——

測(cè)定用樣品溶液相當(dāng)于樣品的質(zhì)量.g;

0.014——氮的毫摩爾質(zhì)量，

g/mmol。?-2)xc×0.014x100?x×20/100·

氨基酸態(tài)氨(%)=結(jié)

果

計(jì)

算說(shuō)明及注意事項(xiàng)·也可用雙指示劑法指示終點(diǎn)?！ご朔?zhǔn)確快速，適用于測(cè)定食品中游離氨基酸?！す腆w樣品應(yīng)先進(jìn)行粉碎，準(zhǔn)確稱樣后用水萃取，然后測(cè)定萃取液；液體試樣如醬油、飲料等可直

接吸取試樣進(jìn)行測(cè)定。。若樣品顏色較深或渾濁需用電位滴定法進(jìn)行測(cè)定。氨基酸的分離及測(cè)定·

薄層色譜法。氨基酸自動(dòng)分析儀法。氣相色鐠法液相色譜

法薄

層

色

譜

法原理。取一定量經(jīng)水解的樣品溶液，滴在制好的薄層板上，

在溶劑系統(tǒng)中進(jìn)行雙向上行法展開(kāi)，樣品各組分在薄

層板上經(jīng)過(guò)多次的被吸附、解吸、交換等作用，同一

物質(zhì)具有相同的Rf

值，不同成分則有不同的Rf

值，因

而各種氨基酸可達(dá)到彼此分離的目的。然后用茚三酮

顯色，與標(biāo)準(zhǔn)氨基酸進(jìn)行對(duì)比，即可鑒別樣品中所含

氨基酸的種類，從顯色斑點(diǎn)顏色的深淺可大致確定其含量。氨基酸自動(dòng)分析儀法。

氨基酸的組分分析，現(xiàn)代廣泛的采用離子交換法，并由自動(dòng)化的儀器來(lái)完成。0

乃

理

：

利

用

久

種

氪

其

酸

的

酸

堿

性

，

極

性

和

分

子

量

大

小先是導(dǎo)酸

酸會(huì)和導(dǎo)極

的每氨

，灰其提次感是

性

洗，

，堿

的；氨分基子酸量小用的茚比三酮顯色，從而定量各種氨基酸?！?/p>

定量測(cè)定的依據(jù)：

氨基酸和茚三酮反應(yīng)生成藍(lán)紫色化合物的顏色深淺與各有關(guān)氨基酸的含量成正比。但脯氨酸和羥脯氨酸則生成黃棕色化合物，故需在另外波長(zhǎng)處定量測(cè)定?！ぐ被岱治鰞x有兩種，

一種是低速型，使用300~

400目的離子交換樹(shù)脂；另一種是高速型，使用直

徑4～6um

的樹(shù)脂。不論哪一種，在分析組成蛋白

質(zhì)的各種氨基酸時(shí)，都用檸檬酸緩沖液；完全分

離和定量40～46種游離氨基酸時(shí)，則使用檸檬酸

鋰緩沖液。但分析后者時(shí)，由于所用緩沖液種類

多，柱溫也要變?yōu)槿齻€(gè)梯度，因此一般不能用低

速型。氣相色譜法原理·

將本身沒(méi)有揮發(fā)性的氨基酸轉(zhuǎn)變?yōu)檫m合于

氣相色鐠分析的衍生物——三氟?；?/p>

酯。它包括用正丁醇的酯化合用三氟乙酸

酐

(TFFAA)

的?；瘍筛鞑襟E。將?；?/p>

的氨基酸衍生物進(jìn)行氣相色鐠分析。液相色譜法原理·蛋白質(zhì)樣品經(jīng)酸或堿水解后再用丹磺酰氯進(jìn)行衍生化作用而溶解于流動(dòng)相溶液中，

采用C8

反相柱的高壓液相色鐠儀分離并用

熒光檢測(cè)器進(jìn)行測(cè)定，即可測(cè)定出各種氨

基酸的含量。方法的比較·

樣品的比較·

原理。靈敏性。速度1.

樣品的比較：·

采用凱氏定氮法和紅外光譜法則樣品幾

乎不需要多加處理，20目或更小的顆粒一般都可以滿足這些測(cè)定方法的要求，一

些更新型的NIR

儀能夠直接測(cè)定不經(jīng)磨碎或其他方法處理的完整的谷物，

以及其他粗糙的顆粒產(chǎn)品。本章中介紹的其他方法則要求原料必須是微小的顆粒，以便于從復(fù)雜的食品體系中抽提蛋白質(zhì)。2.

原理：·

杜馬斯法和凱氏定氮法直接測(cè)定食品中有

機(jī)氮元素的總量。其他方法測(cè)定蛋白質(zhì)的

各種性質(zhì)，例如，雙縮脲測(cè)定多肽鍵，福

林酚法測(cè)定多肽鍵、酪氨酸和色氨酸，紅

外光譜法利用樣品特別是多肽鍵經(jīng)紅外波

長(zhǎng)的光輻射時(shí)的能量吸收直接測(cè)定蛋白質(zhì)

含

量

。3.

靈

敏

性

：·

凱氏定氮法、杜馬斯法、雙縮脲法和陰離子染色法的靈敏度低于紫外測(cè)定法、福林

酚法、

BCA

法或Bradford法。4.

速

度

：·

在儀器經(jīng)

適

當(dāng)

的

調(diào)

試

后

，紅外光譜法可能

是上述討論過(guò)的最為快速的方法。在涉及

到

比色測(cè)定的方法中，在和顯色試劑混合

前，必須把蛋白質(zhì)從干擾實(shí)驗(yàn)的不溶性物

質(zhì)中分離出來(lái)，或者在混和后從顯色的蛋

白質(zhì)-試劑復(fù)合物中除去不溶性物質(zhì)，但是

比色法的測(cè)定速度還是快于凱氏定氮法。特殊的注意事項(xiàng)·

1

.

針對(duì)具體的應(yīng)用、靈敏度、精確度、重現(xiàn)性以及食品的物化性質(zhì)來(lái)考慮選擇適用的測(cè)定方法?！?

.

食品加工方法，如加熱可能會(huì)減弱分析時(shí)

蛋白質(zhì)萃取的能力，從而在涉及萃取的步驟時(shí)

會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)含量的測(cè)定偏低。。3.除了凱氏定氨法和紫外測(cè)定法，其他所有方

法對(duì)純化蛋白質(zhì)的測(cè)定都需要使用標(biāo)準(zhǔn)或參比蛋白質(zhì)，樣品中的蛋白質(zhì)必須與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)具

有相似的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)特殊的注意事項(xiàng)·4.非蛋白氮存在于所有食品中。要測(cè)定蛋白氨，

樣品通常先要在堿性條件下萃取蛋白質(zhì)，然后用

三氯醋酸或磺基水楊酸沉淀。酸的使用濃度影響沉淀得率，因此，非蛋白氮的含量隨所用試劑的

種類和濃度而變化。加熱能夠幫助酸、乙醇或其

他有機(jī)溶劑沉淀蛋白質(zhì)。除了酸沉淀法用于非蛋

白質(zhì)的測(cè)定外，其他較少數(shù)方法如透析、超濾和

柱色譜法也能從含少量非蛋白組分的物質(zhì)中分離得到蛋白質(zhì)。特殊的注意事項(xiàng)。5.在測(cè)定食品蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值如蛋白質(zhì)消化率

和蛋白質(zhì)功效比

(PER)

時(shí)，凱氏定氮法采用6.25

的換算系數(shù)來(lái)計(jì)算蛋白質(zhì)的含量。如果相當(dāng)數(shù)量

的非蛋白氮存在于食品中，測(cè)得的PER值就可能會(huì)

偏低。如果食物樣品中的非蛋白氮含量較高(特

別是如果非蛋白氮不含許多氨基酸或者小肽),所得到的PER值可能會(huì)低于含有相似的蛋白質(zhì)結(jié)

構(gòu)

成份，但非蛋白氮含量較低的樣品的PER值?？偨Y(jié)·本章介紹了基于蛋白質(zhì)和氨基酸的特性來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)的方法，其中杜馬斯法和凱氏定氮法測(cè)定氨含量，雙縮脲法和福林酚法利用銅-肽鍵的

反應(yīng)來(lái)分析，紫外280nm

比色法、染色法、茚三酮法和福林酚法涉及到了氨基酸性質(zhì)。BCA法利用蛋白質(zhì)在堿性溶液中的還原性，紅外光譜法則基于多肽對(duì)紅外波長(zhǎng)光輻射的吸收性質(zhì)。不同方法的分析速度和靈敏度各不相同?！?/p>

不同食品體系的復(fù)雜性導(dǎo)致各種蛋白質(zhì)分析方

法都會(huì)有一些問(wèn)題。通常都要使用經(jīng)選擇的蛋白質(zhì)作為標(biāo)準(zhǔn)(如凱氏定氮)方法校正。第三節(jié)

蛋白質(zhì)的定量測(cè)定關(guān)于氮-蛋白質(zhì)換算等數(shù)6.25

二

二

6.38山5.956.25凱氏定氮法常量凱氏定氮法1.

原理樣品與濃硫酸和催化劑一同加熱消化，使蛋白質(zhì)分解，其中碳和氫被氧化為二氧化碳和水逸出，而樣品中的有機(jī)氮轉(zhuǎn)化為氨與硫酸結(jié)合成硫酸銨。然后加堿蒸餾，使氨蒸出。整個(gè)過(guò)程分三步：消化、蒸餾、吸收與滴定

消化2NH?(CH?)?COOH+13H?SO?——(NH?)2SO?+6CO?+12SO?+16H?O<1>加硫酸鉀

作為增溫劑，提高溶液沸點(diǎn)<2>

加

硫

酸

銅

作為催化劑、消化終點(diǎn)指示劑<3>

加氧化劑

加速有機(jī)物氧化速度a.

消

化

裝

置凱

氏

燒

瓶蒸餾NII?++

OH-==

NH?+H?O吸收液b.

蒸餾吸收裝置進(jìn)樣漏斗玻璃珠蒸餾燒光電妒冷凝管鐵支架影響氨化完全和速度的因素·(1)K氏燒

瓶

和

取

樣

量·

(2)分解劑1g樣品

K?SO?

:H?SO?

=7g:12ml還有

一

種比例：K?S

O?:H?SO?=10g:20ml

吸收與滴定<1>用4%硼酸吸收，用鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定指示劑：混合指示劑(甲基紅—溴甲基酚綠)指示

劑

紅

色

一綠色

紅色(

酸

)

(

堿

)

(

酸

)反應(yīng)式為：NH?+H?BO?==NH?*+H?BO?<2>用過(guò)量的H?SO?

或

HC1

標(biāo)準(zhǔn)溶液吸收，再用

NaOH

標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定過(guò)剩的酸液。現(xiàn)測(cè)定某一種食品的蛋白質(zhì)的含量，這種樣品含有大量的脂肪

，樣品經(jīng)過(guò)處理后加入濃硫酸，為了使?jié)饬蛩崤c樣品充分

結(jié)合，經(jīng)振搖后大火加熱進(jìn)行消化；消化

2h

后，估計(jì)消化完全，取出消化液加入少量

H

進(jìn)

行

蒸

餾

，

硼

酸

(

加

入

了

指

示

劑

NaPH基紅-溴甲基酚綠)作為吸收液，最后對(duì)吸收液進(jìn)行滴定。計(jì)

算C1O

〇〇◎·X

為樣品中蛋白質(zhì)的含量·V?為樣品消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液的體積。V?

為試劑空白消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液的體積。C

為鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液的濃度·Mv

為氨的摩爾質(zhì)量·W

為樣品的質(zhì)量·

K為氮換算為蛋白質(zhì)的系數(shù)X

=二

、雙縮脲法NH?—CO—

NH

?+NH?

—CO—NH?

△150~160℃。NH?—CO—NH—CO—NH?+NH?雙縮脲雙縮脲能和硫酸銅的堿性溶液生成紫色絡(luò)和物。O12345標(biāo)準(zhǔn)蛋白液/ml0.20.40.60.81.0蛋白濃度/(mg/ml)2.04.06.08.010.0蒸餾水/ml1.00.80.60.40.20.0雙縮脲試劑/mlAs404.04.04.04.04.04.0取兩組測(cè)定的Aso值的平均值，即As4o為縱坐標(biāo)，蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。操作方法。

1、制作標(biāo)準(zhǔn)曲線取10支干試管分成兩組，按下表平行操作O1樣

品

稀

釋

液

/

m

l0.5蒸

餾

水

/

m

l1.00.5雙縮脲試劑/mlAs?o4.04.02、

樣品測(cè)定取4支試管分成兩組，按下表平行操作：3、計(jì)算·取兩組測(cè)定的平均值計(jì)算：固體樣

品蛋·Y為標(biāo)準(zhǔn)曲線查得蛋白質(zhì)得濃度(

mg/ml)o

N

為稀釋倍數(shù)c

為樣品原濃度(

mg/ml)

。福

林

-

酚

法(

雙