關(guān)于實驗二細(xì)菌的簡單染色與革蘭氏染色一、目的要求1、鞏固顯微鏡的使用方法；2、掌握細(xì)菌的簡單染色和革蘭氏染色的原理和方法。第2頁,共20頁，2024年2月25日，星期天二、基本原理第3頁,共20頁，2024年2月25日，星期天革蘭氏染色

用于生物染色的染料主要有堿性染料、酸性染料和中性染料三大類。

堿性染料的離子帶正電荷，能和帶負(fù)電荷的物質(zhì)結(jié)合。因細(xì)菌蛋白質(zhì)等電點較低，當(dāng)它生長于中性、堿性或弱酸性的溶液中時常帶負(fù)電荷，所以通常采用堿性染料（如美蘭、結(jié)晶紫、堿性復(fù)紅或孔雀綠等）使其著色。

酸性染料的離子帶負(fù)電荷，能與帶正電荷的物質(zhì)結(jié)合。當(dāng)細(xì)菌分解糖類產(chǎn)酸使培養(yǎng)基pH下降時，細(xì)菌所帶正電荷增加，因此易被伊紅、酸性復(fù)紅或剛果紅等酸性染料著色。

中性染料是前兩者的結(jié)合物又稱復(fù)合染料，如伊紅美蘭、伊紅天青等。第4頁,共20頁，2024年2月25日，星期天簡單染色法是只用一種染料使細(xì)菌著色以顯示其形態(tài)，簡單染色不能辨別細(xì)菌細(xì)胞的構(gòu)造。革蘭氏染色法是1884年由丹麥病理學(xué)家C.Gram所創(chuàng)立的。革蘭氏染色法可將所有的細(xì)菌區(qū)分為革蘭氏陽性菌（G+）和革蘭氏陰性菌（G-）兩大類，是細(xì)菌學(xué)上最常用的鑒別染色法。該染色法所以能將細(xì)菌分為G+菌和G-菌，是由這兩類菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和成分的不同所決定的。第5頁,共20頁，2024年2月25日，星期天革蘭氏陽性和陰性菌細(xì)胞壁成分比較成分占細(xì)胞壁干重的%

革蘭氏陽性菌革蘭氏陰性菌肽聚糖含量很高（50-90）含量很低（~10）磷壁酸含量較高（<50）無類脂質(zhì)一般無（<2）含量較高（~20）蛋白質(zhì)無含量較高第6頁,共20頁，2024年2月25日，星期天G-菌的細(xì)胞壁中含有較多易被乙醇溶解的類脂質(zhì)，而且肽聚糖層較薄、交聯(lián)度低，故用乙醇或丙酮脫色時溶解了類脂質(zhì)，增加了細(xì)胞壁的通透性，使結(jié)晶紫和碘的復(fù)合物易于滲出，結(jié)果細(xì)菌就被脫色，再經(jīng)沙黃復(fù)染后就成紅色。G

菌細(xì)胞壁中肽聚糖層厚且交聯(lián)度高，類脂質(zhì)含量少，經(jīng)脫色劑處理后反而使肽聚糖層的孔徑縮小，通透性降低，因此細(xì)菌仍保留初染時的顏色。第7頁,共20頁，2024年2月25日，星期天三、實驗器材1、材料培養(yǎng)12-16h的枯草桿菌（Bacillussubtilis），培養(yǎng)24小時的大腸桿菌（Escherichiacoli）2、染色液和試劑

草酸銨結(jié)晶紫、碘液、95%乙醇、沙黃、二甲苯、香柏油3、器材

廢液缸、洗瓶、載玻片、接種環(huán)、酒精燈、擦鏡紙、顯微鏡等。第8頁,共20頁，2024年2月25日，星期天四、實驗方法及步驟1、簡單染色（1）涂片取干凈載玻片一塊，在載玻片的左、右各加一滴蒸餾水，按無菌操作法取菌涂片，左邊涂枯草桿菌，右邊涂大腸桿菌，做成濃菌液。再取干凈載玻片一塊將剛制成的枯草桿菌液挑2-3環(huán)涂在左邊制成薄的涂面，將大腸桿菌的濃菌液取2-3環(huán)涂在右邊制成薄涂面。亦可直接在載玻片上制薄的涂面，注意取菌不要太多。第9頁,共20頁，2024年2月25日，星期天第10頁,共20頁，2024年2月25日，星期天（2）晾干讓涂片自然晾干或者在酒精燈火焰上方文火烘干。（3）固定手執(zhí)玻片一端，讓菌膜朝上，通過火焰2-3

次固定（以不燙手為宜）。（4）染色將固定過的涂片放在廢液缸上的擱架上，加沙黃染色1-2min。（5）水洗用水洗去涂片上的染色液。（6）干燥將洗過的涂片放在空氣中晾干或用吸水紙吸干。（7）鏡檢先低倍觀察，再高倍觀察，并找出適當(dāng)?shù)囊曇昂螅瑢⒏弑剁R轉(zhuǎn)出，在涂片上加香柏油一滴，將油鏡頭浸入油滴中仔細(xì)調(diào)焦觀察細(xì)菌的形態(tài)。第11頁,共20頁，2024年2月25日，星期天涂片干燥固定染色水洗鏡檢簡單染色方法干燥第12頁,共20頁，2024年2月25日，星期天2、革蘭氏染色（1）涂片

與簡單染色涂片相同；（2）晾干

與簡單染色法相同；（3）固定

與簡單染色法相同；（4）初染

將玻片置于廢液缸玻片擱架上，加適量（以蓋滿細(xì)菌涂面）的結(jié)晶紫染色液染色1min；（5）水洗

傾去染色液，用水小心地沖洗；第13頁,共20頁，2024年2月25日，星期天（6）媒染

滴加碘液，媒染1min；（7）水洗

用水洗去碘液；（8）脫色

將玻片傾斜，連續(xù)滴加95%乙醇脫色20-25s至流出液無色，立即水洗；（9）復(fù)染

滴加沙黃復(fù)染5min；（10）水洗

用水洗去涂片上的沙黃染色液；（11）晾干

將染好的涂片放空氣中晾干或者用吸水紙吸干；（12）鏡檢

鏡檢時先用低倍，再用高倍，最后用油鏡觀察，并判斷菌體的革蘭氏染色反應(yīng)性。第14頁,共20頁，2024年2月25日，星期天第15頁,共20頁，2024年2月25日，星期天五

注意事項1、革蘭氏染色成敗的關(guān)鍵是酒精脫色。如脫色過度，革蘭氏陽性菌也可被脫色而染成陰性菌；如脫色時間過短，革蘭氏陰性菌也會被染成革蘭氏陽性菌。脫色時間的長短還受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影響，難以嚴(yán)格規(guī)定，需要多加練習(xí)；2、選用幼齡的細(xì)菌。G+菌培養(yǎng)12h-16h，E.coli培養(yǎng)24h。若菌齡太老，由于菌體死亡或自溶常使革蘭氏陽性菌轉(zhuǎn)呈陰性反應(yīng)。第16頁,共20頁，2024年2月25日，星期天六思考題及作業(yè)題1、當(dāng)對未知菌進行革蘭氏染色時，如何保證操作正確及結(jié)果可靠？

2、簡述革蘭氏染色的原理和步驟。第17頁,