構(gòu)巢曲霉鈣信號系統(tǒng)相關(guān)蛋白AnPcpA和AnPefA的分子特征及功能研究眾所周知,鈣信號是真核生物十分保守的第二信使,也可以說是細胞生存與死亡的信號。鈣信號系統(tǒng)幾乎介導所有的生理活動,包括生長、發(fā)育、增殖、分泌、物質(zhì)運輸以及逆境響應等。雖然已經(jīng)證實真菌中存在著很多重要的鈣信號系統(tǒng)成員如鈣離子通道、鈣調(diào)素、鈣調(diào)磷酸酶等,已知它們在真菌發(fā)育、對抗逆境等起著十分重要的作用。但是,對于真菌鈣信號系統(tǒng)的互作蛋白、下游靶標以及調(diào)控網(wǎng)絡仍然知之甚少,更不清楚它們是如何參與真菌對于藥物逆境的耐受性。曲霉(Aspergillus)是自然界中分布極為廣泛的一大類真菌,它們包含了模式真菌---構(gòu)巢曲霉(A.nidulans)、工業(yè)生產(chǎn)上使用的米曲霉(A.oryzae)、黑曲霉(A.niger),也包括與侵襲性曲霉感染相關(guān)的煙曲霉(A.fumigatus)、黃曲霉(A.flavus)、土曲霉(A.terreus)等。構(gòu)巢曲霉具有結(jié)構(gòu)簡單、遺傳背景清楚、可以有性雜交等優(yōu)勢,因此是用來研究很多基礎生物學問題的模式生物;同時它又是條件致病菌,也可以用來研究醫(yī)學生物學問題。本課題以構(gòu)巢曲霉為研究材料,應用生物信息學方法找到兩個鈣信號系統(tǒng)候選蛋白AnPcpA和AnPefA。通過應用融合PCR技術(shù)對基因進行定點敲除,熒光蛋白標記技術(shù)和啟動子替換等技術(shù)研究它們的生物學功能。發(fā)現(xiàn)這兩個候選蛋白在構(gòu)巢曲霉極性生長,胞質(zhì)分裂,逆境響應等重要生命活動中發(fā)揮重要作用。生物信息學分析表明構(gòu)巢曲霉AnPcpA具有鈣信號系統(tǒng)核心蛋白鈣調(diào)素的結(jié)合域,因此我們推測AnPcpA可能和鈣信號系統(tǒng)相關(guān)。我們的研究發(fā)現(xiàn),AnPcpA是必需基因,參與構(gòu)巢曲霉孢子萌發(fā)和菌絲生長發(fā)育過程。使用綠色熒光蛋白標記AnPcpA,發(fā)現(xiàn)GFP-AnPcpA聚集成點狀定位在細胞核位置,并且CaM要大量聚集在菌絲生長頂端依賴AnPcpA發(fā)揮功能。另外,通過調(diào)控乙醇脫氫酶啟動子抑制AnPcpA表達導致細胞極性生長丟失極為嚴重,細胞核重新分布。最有趣的現(xiàn)象是,成熟菌絲缺失AnPcpA功能后細胞形狀和細胞骨架發(fā)生重塑,并且伴隨著菌絲腫脹部位堆積大量細胞核,菌絲變細部位沒有細胞核。進一步跟蹤細胞核出現(xiàn)重排的原因,發(fā)現(xiàn)原來是AnPcpA功能缺失導致細胞微管組織成核受損,這也表明AnPcpA通過影響微管組織來影響細胞核錨定。本論文首次在絲狀真菌活細胞中揭示了AnPcpA的生物學功能。AnPefA是生物信息學預測和鈣信號相關(guān)的一個蛋白,它含有多個鈣離子結(jié)合位點和EF-hand結(jié)構(gòu)。由于哺乳動物研究成果表明AnPefA表達水平影響抗癌藥物的藥效,因此我們推測AnPefA可能參與鈣信號系統(tǒng)調(diào)控曲霉對逆境的響應。我們的研究發(fā)現(xiàn)AnPefA參與曲霉耐藥現(xiàn)象。使用熒光蛋白標記AnPefA,發(fā)現(xiàn)GFP-AnPefA分布在活細胞的整個細胞質(zhì)中。缺失AnPefA基因?qū)е聵?gòu)巢曲霉對伊曲康唑耐受,并且耐受程度依賴鈣調(diào)磷酸酶。AnPefA基因缺失提高了曲霉在ITZ環(huán)境下的存活率。更有趣的是,缺失了AnPefA的細胞后在伊曲康唑環(huán)境下凋亡率減少,反之提高AnPefA表達使得細胞凋亡率升高。另外發(fā)現(xiàn),細胞缺失AnPefA功能后細胞膜組分麥角固醇含量增高,而細胞藥物外排泵的活力沒有改變。我們的數(shù)據(jù)表明AnPefA通過影響細胞存活率和麥角固醇合成量從而影響曲霉對藥物的耐受力。本論文首次揭示AnPefA在曲霉耐藥現(xiàn)象中的生物學功能。綜上所述,本論文首次具體描述了AnPcpA和AnPefA在曲霉極性生長,胞質(zhì)分裂,逆境響應等重要生命活動中發(fā)揮的作用,這不僅為鈣信