ICS11.220

B41

備案號：58536-2018DB21

遼寧省地方標準

DB21/T2827.1—2017

畜禽疫病防治與凈化技術規(guī)范

第1部分：豬繁殖與呼吸綜合征病毒經典株

與高致病性變異株RT-PCR鑒別檢測方法

Teohnicalspecificationsofpreventionanderadicationofanimalepidemicdisease

Part1:ART-PCRmethodtodifferentiatethehighlypathogenicandclassicalporcine

reproductiveandrespiratorysyndromevirus

DB21/T2827.1-2017

前言

標準《畜禽疫病防治與凈化技術規(guī)范》按照GB/T1.1-2009給出的規(guī)則起草，分為七個部分：

——豬繁殖與呼吸綜合征美洲經典株與高致病性變異株病毒RT-PCR鑒別檢測方法

——動物炭疽防治技術規(guī)范

——豬偽狂犬病防治技術規(guī)范

——規(guī)模豬場藍耳病免疫凈化技術規(guī)范

——雞白痢平板凝集試驗操作技術規(guī)范

——種雞場雞白痢凈化技術規(guī)范

——鵝血清HA-HI抗體檢測技術規(guī)范

本部分為標準《畜禽疫病防治與凈化技術規(guī)范》的第1部分

本部分由遼寧省動物疫病預防控制中心提出。

本部分由遼寧省畜牧獸醫(yī)局歸口。

本部分起草單位：遼寧省動物疫病預防控制中心，遼寧省動物醫(yī)學研究院。

本部分主要起草人：楊本勇，曹東，趙鳳菊，申貫男，李井春，關淼，楊國麗，王竹，吳運譜，李

冰，高慎陽，孫傳祿，鄧文超。

II

DB21/T2827.1—2017

畜禽疫病防治與凈化技術規(guī)范

第1部分：豬繁殖與呼吸綜合征美洲經典株與高致病性變異株病毒

RT-PCR鑒別檢測方法

1范圍

本標準規(guī)定了豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）美洲經典株與高致病性變異株RT-PCR檢測方法的

實驗材料、儀器設備、試劑、操作步驟和結果判定，并介紹了其原理。

本標準適用于豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）感染豬血清及臨床病料等樣品中病毒核酸檢測。

2規(guī)范性引用文件

下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

GB/T6682-1992分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法

中華人民共和國農業(yè)部公告第302號獸醫(yī)實驗室生物安全技術管理規(guī)范

3縮略語

下列縮略語適用于本標準。

DEPC焦炭酸二乙酯

RNA核糖核酸

RT-PCR反轉錄聚合酶鏈反應

dNTP脫氧核苷酸三磷酸

bp堿基對

4原理

PRRSV是一種RNA病毒。RNA反轉錄產生的cDNA可作為PCR模板進行擴增。根據(jù)高致病性PRRSV基因組

非結構蛋白Nsp2編碼區(qū)缺失90個核苷酸的特點，在缺失區(qū)域的兩端設計一對引物，在DNA聚合酶催化下，

以母鏈DNA為模板，以引物為延伸起點，通過變性、退火和延伸，經典株病毒與高致病性變異株病毒分

別擴增出不同大小的DNA片段。

5實驗材料、儀器設備和試劑

5.1實驗材料

眼科剪、眼科鑷、稱量紙、1.5mL滅菌離心管（經DEPC水處理）、0.2mL薄壁PCR管、瓊脂糖、500

mL量筒、500mL三角瓶、吸頭（10μL、200μL、1000μL）。

5.2儀器設備

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DB21/T2827.1—2017

分析天平、低溫高速離心機、PCR擴增儀、電泳儀、電泳槽、紫外凝膠成像儀（或紫外分析儀）、

－70℃冰箱、微波爐、組織研磨器、－20℃冰箱、可調移液器（最大量程分別為2μL、20μL、200μL、

1000μL）。

5.3試劑

5.3.12.5mmol/LdNTP。

5.3.2引物：上游引物5′-CGAATCAGACAACCGAACA-3′，下游引物5′-GACGCAGACAAATCCAGAG-3′。

5.3.310倍PCR緩沖液。

5.3.41%溴化乙錠（EB）溶液（見第A.1）。

5.3.5電泳緩沖液（50倍）（見第A.2）。

5.3.61%瓊脂糖凝膠（見第A.3）。

5.3.775%乙醇（見第A.4）。

5.3.8滅菌DEPC水（見第A.5）。

5.3.9上樣緩沖液(見第A.6)。

5.3.10電泳緩沖液（1倍）（見第A.7）。

5.3.11磷酸鹽緩沖液（0.01mol/L、pH7.4）（見第A.8）。

5.3.12阿氏液(見A.9)。

5.3.13其他試劑：10U/μLAMV反轉錄酶、50U/μLRNA酶抑制劑、5U/μLTaqDNA聚合酶、異丙醇、

25mmol/L氯化鎂溶液。

注：除另有規(guī)定，所用試劑均為分析純，水為符合GB/T6682－1992的滅菌雙蒸水或超純水。

6操作步驟

6.1樣品的采集、保存運送和處理

6.1.1樣品采集

組織樣品：無菌采集淋巴結、肺臟、扁桃體、脾臟等組織樣品3～5g裝入潔凈的小瓶內或其他滅菌容

器，編號備用。

6.1.1.1拭子樣品：采集鼻拭子時將棉拭子深入鼻腔來回刮3～5次，取鼻腔分泌物；采肛門拭子時將

棉拭子深入肛門轉一圈沾取糞便。將鼻腔拭子和肛門拭子放入盛有1.0mLPBS的Eppendorf管中，編

號備用。

6.1.1.2血清樣品：用無菌注射器從耳靜脈或前腔靜脈采集血液3～5mL，血清析出后吸入至無菌的

Eppendorf管中，編號備用。

6.1.1.3抗凝血樣品：先用無菌注射器吸入抗凝劑（阿氏液）2～3mL，再從耳靜脈或前腔靜脈采集等

量血液，快速混勻后注入無菌的Eppendorf管中，編號備用。

6.1.2樣品保存與運送

6.1.2.1樣品保存：采集的樣品24小時內冷藏送檢，若不能則冷凍保存，避免反復凍融。

6.1.2.2樣品運送：樣品裝入保溫壺或保溫桶中加冷凍劑和防震材料，加蓋密封，運送到實驗室。按

照《獸醫(yī)實驗室生物安全技術管理規(guī)范》進行樣品的生物安全標識。

6.1.3樣品處理

2

DB21/T2827.1—2017

6.1.3.1組織樣品：取待檢樣品2.0g于潔凈、滅菌并烘干的研缽中充分研磨，加10mL磷酸鹽緩沖

液(0.01mol/L、pH7.4)混勻制成1：5懸液，4℃下3000rpm離心15min，取上清液轉入無菌的

1.5mLEppendorf管中，編號備用。

6.1.3.2拭子樣品：將拭子樣品懸液轉入1.5mLEppendorf管中，4℃下5000rpm離心5min，取

上清液轉入另一新的無菌1.5mLEppendorf管中，編號備用。

6.1.3.3血清樣品：無需處理，直接提取核酸。

6.1.3.4抗凝血樣品：無需處理，直接提取核酸。

6.2RT－PCR檢測

6.2.1病毒RNA的提取

6.2.1.1取n個新的經DEPC水處理過的1.5mL滅菌Eppendorf管，其中n為被檢樣品、陰性對照、

陽性對照的數(shù)量之和，編號。

6.2.1.2每管加入750μL裂解液，然后分別加入處理過的被檢樣品、陰性對照、陽性對照各250μL，

顛倒混勻，室溫靜置5min。

6.2.1.3每管加入250μL氯仿，蓋緊離心管，用手劇烈搖蕩離心管15sec（或混勻器上振蕩混勻15

sec），室溫放置15min。

6.2.1.44℃、12000g離心15min，取上層水相0.5mL于一新的經DEPC水處理過的1.5mL滅菌

Eppendorf管中，每管加入0.5mL異丙醇，顛倒混勻，室溫放置10min，4℃、12000g離心15min。

6.2.1.5小心棄去上清液，倒置于吸水紙上，沾干液體，不同樣品應在吸水紙不同地方沾干，加入－

20℃預冷的75%乙醇1mL，輕輕旋轉洗滌后于4℃、12000g離心10min。

6.2.1.6小心棄去上清液，倒置于吸水紙上，沾干液體，不同樣品應在吸水紙不同地方沾干，室溫放

置或真空干燥5～10min，不能過于干燥，以免降低RNA的溶解度。

6.2.1.7每管加20μLDEPC水和1μLRNA酶抑制劑，輕輕混勻，溶解管壁上的RNA，－70℃保存?zhèn)?/p>

用。

6.2.2RT－PCR擴增

6.2.2.1RT－PCR反應體系組成（總體積24μL）

DEPC水14.5μL

2.5mmol/LdNTP2μL

10μmol/L上游引物1μL

10μmol/L下游引物1μL

25mmol/L氯化鎂溶液1.5μL

10倍PCR緩沖液2.5μL

AMV反轉錄酶0.5μL

RNA酶抑制劑0.5μL

5U/μLTaqDNA聚合酶0.5μL

6.2.2.2擴增體系的配制

設PCR反應數(shù)為n，其中n為被檢樣品、陰性對照、陽性對照的數(shù)量之和，向每個PCR管中分裝24

μL的反應體系。

6.2.2.3加樣

3

DB21/T2827.1—2017

在各設定的PCR管中加入6.2.1中制備的1μLRNA溶液,蓋緊管蓋，離心除去氣泡，放入PCR擴增儀

內，記錄樣品擺放次序。

6.2.2.4RT－PCR反應程序設置

42℃45min，95℃3min；擴增條件為94℃30sec，58℃30sec，72℃45sec，35個循

環(huán)后，72℃延伸10min。

6.2.3電泳

將PCR擴增產物5－8μL與1－2μL上樣緩沖液混合，加樣于1%瓊脂糖凝膠孔中，瓊脂糖凝膠板一側

點樣孔加入DL2000MarkDNA分子質量標準物，以5V/cm電壓電泳30min，用紫外凝膠成像儀觀察結果。

7結果判定

當經典株陽性對照出現(xiàn)約835bp、高致病性變異株陽性對照出現(xiàn)約745bp擴增帶、陰性對照未出現(xiàn)

目的帶時，實驗結果成立。被檢樣品出現(xiàn)835bp擴增帶為經典株PRRSV陽性，出現(xiàn)745bp擴增帶為高致

病性變異株陽性。

M123

M——DNA分子量標準（DL2000Marker）；

1——PRRSV高致病性變異株（HuN株）陽性對照；

2——PRRSV經典株（CH-1a株）陽性對照；

3——陰性對照。

4

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附錄A

（規(guī)范性附錄）

試劑的配制

A.1１%溴化乙錠（EB）溶液

溴化乙錠0.2g

滅菌雙蒸水加至20mL

A.2電泳緩沖液（50倍）

A.2.10.5mol/L乙二銨四乙酸二鈉（EDTA）溶液（pH8.0）

二水乙二銨四乙酸二鈉（分析純）18.61g

滅菌雙蒸水80mL

氫氧化鈉調pH至8.0

滅菌雙蒸水加至100mL

A.2.2TAE(三羥甲基氨基甲烷－乙酸)電泳緩沖液（50倍）

羥基甲基氨基甲烷（Tris）（分析純）242g

冰乙酸57.1mL

0.5mol/L乙二銨四乙酸二鈉（EDTA）溶液（pH8.0）100mL

滅菌雙蒸水加至1000mL

用時用滅菌雙蒸水稀釋使用。

A.31%瓊脂糖凝膠

瓊脂糖（電泳級）2g

TAE電泳緩沖液4mL

滅菌雙蒸水196mL

微波爐中完全融化，加溴化乙錠（EB）溶液20μL。

A.475%乙醇

無水乙醇（分析純）750mL

滅菌DEPC水250mL

A.5滅菌DEPC水

雙蒸水1000mL

DEPC1mL

用磁力攪拌器室溫下持續(xù)攪拌過夜，分瓶包裝后121℃高壓滅菌25min。

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A.6上樣緩沖液

溴酚藍0.2g，加雙蒸水10mL過夜溶解，50g蔗糖加入50mL水溶解后，移入已溶解的溴酚藍溶液

中，搖勻定容至100mL。

A.7電泳緩沖液（1倍）

電泳緩沖液（50倍）10mL

滅菌雙蒸水490mL

A.8磷酸鹽緩沖液（0.01mol/L，pH7.4，PBS）

氯化鈉（NaCl）8.0g

氯化鉀（KCl）0.2g

磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）2.9g

磷酸二氫鉀（KH2PO4）0.2g

將上列試劑按次序加入定量容器中，加適量蒸餾水溶解后，再定容至1000mL，調pH至7.4，高壓

消毒滅菌112kPa20min，4℃冰箱保存。

A.9阿氏液

葡萄糖2.05g

檸檬酸鈉0.8g

檸檬酸0.055g

氯化鈉0.42g

加蒸餾水至100mL，溶解后調pH值至6.1，69kPa15min高壓滅菌，4℃冰箱保存。

_________________________________

6

DB21/T2827.1-2017

目次

前言................................................................................II

1范圍..............................................................................1

2規(guī)范性引用文件....................................................................1

3縮略語............................................................................1

4原理..............................................................................1

5實驗材料、儀器設備和試劑..........................................................1

5.1實驗材料......................................................................1

5.2儀器設備......................................................................1

5.3試劑..........................................................................2

6操作步驟..........................................................................2

6.1樣品的采集、保存運送和處理....................................................2

6.1.1樣品采集..................................................................2

6.1.2樣品保存與運送............................................................2

6.1.3樣品處理..................................................................2

6.2RT－PCR檢測...................................................................3

6.2.1病毒RNA的提取............................................................3

6.2.2RT－PCR擴增...............................................................3

6.2.2.1RT－PCR反應體系組成...................................................3

6.2.2.2擴增體系的配制........................................................3

6.2.2.3加樣..................................................................3

6.2.2.4RT－PCR反應程序設置...................................................4

6.2.3電泳......................................................................4

7結果判定..........................................................................4

附錄A（規(guī)范性附錄）試劑的配制......................................................5

I

DB21/T2827.1-2017

目次

前言................................................................................II

1范圍..............................................................................1

2規(guī)范性引用文件....................................................................1

3縮略語............................................................................1

4原理..............................................................................1

5實驗材料、儀器設備和試劑..........................................................1

5.1實驗材料......................................................................1

5.2儀器設備......................................................................1

5.3試劑