SPR技術和ITC技術在結(jié)構生物學中的應用摘要生物大分子的活性是通過不同分子或相同分子之間的相互作用來實現(xiàn)其生物學功能。在結(jié)構生物學研究領域中，單純解析生物大分子的結(jié)構已不能滿足現(xiàn)代科研的基本要求，所以研究其生物學功能受到了越來越多的重視。本文主要介紹現(xiàn)在常用的SPR技術和ITC技術以及它們在結(jié)構生物學中的應用。關鍵詞SPR技術ITC技術結(jié)構生物學前言結(jié)構生物學是前個世紀后半葉才蓬勃發(fā)展起來的重要學科，通過研究核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子的空間結(jié)構，可以為生物大分子發(fā)揮生理功能的機理提供關鍵解釋[1]。生物分子之間的相互作用奠定了生物生命現(xiàn)象的基礎，因此研究生物分子之間的相互作用可以在分子水平上更加精細地闡述生物反應發(fā)生的機理，揭示生命現(xiàn)象的本質(zhì)[2]。關于蛋白質(zhì)相互作用的檢測手段已有很多，但是其缺點也很明顯。SPR（表面等離子共振）生物傳感技術作為一種新興的光學生物化學檢測技術，與傳統(tǒng)的生化分析方法相比，具有無需標記、靈敏準確、快速、能夠?qū)崿F(xiàn)在線連續(xù)檢測等優(yōu)點[3]。此外，在生物體中的各種生物分子之間的相互作用并不像化學反應那樣劇烈。通過熱力學研究，它能夠在結(jié)合機制的闡明中起重要作用，為藥物的設計提供合理的理論模型[4]。為了研究分子間弱的相互作用力，ITC（等溫滴定量熱分析）技術便應運而生，它在生物熱力學模型的建立、蛋白質(zhì)和配體的結(jié)合以及表面活性劑和聚合物的相互作用中都扮演了關鍵角色[5]。SPR技術SPR（表面等離子共振）是指在光波的作用下，在金屬和電介質(zhì)的交界面上形成的改變光波傳輸?shù)闹C振波[6]。在介質(zhì)（一般為玻璃）表面涂上一層金屬薄膜（一般為金屬），入射光在界面處發(fā)生全內(nèi)反射時，產(chǎn)生的消逝波滲透到金屬薄膜內(nèi)，可以激發(fā)金屬表面等離子體使之產(chǎn)生等離子波。當入射光的入射角和波長在某一適當值時，表面等離子波與消逝波的頻率和波數(shù)相等，此時兩者將發(fā)生共振，入射光能量被吸收，反射光強大幅度減弱，可以從反射光強響應曲線看到一個最小的尖峰，此為共振峰，對應的入射角為SPR角[2]。SPR角隨金屬表面折射率的變化而變化，而折射率的變化又與金屬表面結(jié)合的分子的質(zhì)量成正比。當目標分子結(jié)合到傳感器表面時（圖1），能夠引起SPR角度的變化，我們可以通過檢測諧振角、諧振波長或諧振強度的變化來反應生物分子之間的相互作用[7]。圖1光學無標記生物傳感器插圖[7]SPR的實驗方法：將需要檢測的分子鍵合到生物傳感器的芯片上（該步驟可以委托公司完成），然后將蛋白分子溶液以恒定的流速流過芯片表面。如果檢測的分子能夠與與蛋白分子相互作用，那么生物傳感器表面的質(zhì)量便會增加，改變傳感器表面折射率，從而使共振角度發(fā)生改變。折射率每變化1000RU，那么表示芯片表面每平方毫米有1納克的質(zhì)量發(fā)生改變[8]?，F(xiàn)在實驗室廣泛使用的表面等離子共振傳感器有Biacore系列，它們的光學檢測部件一般包括光源、TM波偏振器、棱鏡、檢測芯片、信號檢測器這六個大的部分（圖2）。光源發(fā)出的光經(jīng)過透鏡后，能產(chǎn)生平行的光束，透過棱鏡，再檢測芯片上質(zhì)量的改變情況，最后的反射光經(jīng)過各級的檢測器、放大器進行處理，在記錄儀上顯示其變化情況。通過系統(tǒng)自帶的計算軟件，計算反應的平衡常數(shù)、解離常數(shù)。圖2光學SPR傳感系統(tǒng)[6]SPR在結(jié)構生物學中的應用SPR技術在生命科學領域都有著廣泛的應用，比如藥物代謝分析，生物檢測，免疫檢測、蛋白質(zhì)功能分析等。下面，主要介紹一下SPR在結(jié)構生物學上的最新應用和成果。到影響。AndrasiM等[17]使用各種不同的方法研究抗人白蛋白單克隆抗體和其抗原蛋白之間的相互作用，實驗表明由ITC獲得的解離常數(shù)數(shù)值與使用ACE(一種研究分子結(jié)合的方法)獲得的值是一致的。BrathU等[18]在研究鈣調(diào)蛋白中與麻醉劑七氟醚的結(jié)合位點時，使用了ITC去測量它們之間的親和力。實驗表明，七氟醚在同與鈣離子結(jié)合的鈣調(diào)蛋白作用時，有低的親和力，然而當缺乏鈣離子時，它們之間沒有相互作用。除此之外，ITC還用在其他許多研究領域。比如馮雪等[19]采用等溫滴定量熱法考察了益氣復脈凍干干粉針與VC注射液及5%的葡萄糖注射液之間的相容性。實驗結(jié)果表明，根據(jù)產(chǎn)生了的能量變化大小，益氣復脈凍干干粉與VC注射液的反應屬于化學反應范疇，而益氣復脈凍干干粉與葡萄糖注射液的反應屬于擴散引起的物理變化。討論與展望以上兩種實驗研究方法因其優(yōu)越性已經(jīng)越來越多地用于結(jié)構生物學的研究之中，但是，以上兩種方法也有各自的問題需要解決。SPR技術待測的分子只局限于大分子，小分子會對其造成嚴重的誤差；對于金屬芯片的要求也比較嚴格；不能消除非特異性結(jié)合帶來的影響。ITC技術很少能夠與其他儀器聯(lián)合，缺乏特異性，對樣品組成要求很高。兩種技術共有的問題是這兩種儀器都很昂貴，成本較高。以上這些缺點都限制了它們的發(fā)展。我們有理由相信，在今后的研究中，隨著這這兩種技術越來越完善，它們的應用必將得到更多的發(fā)展，其前景也會越來越廣闊。參考文獻[1]王宏偉.冷凍電子顯微學在結(jié)構生物學研究中的現(xiàn)狀與展望[J].中國科學:生命科學,2014,10:1020-1028[2]孫小婷,靳嵐,凌沛學.表面等離子共振和等溫滴定量熱技術及其在蛋白質(zhì)相互作用中的應用[J].藥物生物技術,2012,06:540-545[3]孟慶石,勞文燕,潘映紅.表面等離子共振生物傳感器技術及在生命研究中的應用[J].生命科學儀器,2009,01:10-13[4]PerozzoR,FolkersG,ScapozzaL.Thermodynamicsofprotein-ligandinteractions:history,presence,andfutureaspects[J].JReceptSignalTransductRes,2004,24(1-2):1-52[5]婁朋曉,王玉潔,白光月,等.表面活性劑分子間弱相互作用的直接能量表征——高靈敏等溫滴定量熱法[J].ActaPhys.Chim.Sin,2013,29[6]符運良,傅軍,吳英才,袁一方.表面等離子共振傳感技術的發(fā)展與應用[J].激光雜志,2006,06:15-17[7]XudongFan,IanM.White,SiykaI.Shopova,HongyingZhu,JonathanD.Suter,YuzeSun,Sensitiveopticalbiosensorsforunlabeledtargets:Areview,AnalyticaChimicaActa,Volume620,Issues1–2,14July2008,Pages8-26,ISSN0003-2670[8]GulnaraSafina,Applicationofsurfaceplasmonresonanceforthedetectionofcarbohydrates,glycoconjugates,andmeasurementofthecarbohydrate-specificinteractions:Acomparisonwithconventionalanalyticaltechniques.Acriticalreview,AnalyticaChimicaActa,Volume712,27January2012,Pages9-29,ISSN0003-2670[9]JustinC.Deme,MarkA.Hancock,JamesW.Coulton,etc.PurificationandinteractionanalysesoftwohumanlysosomalvitaminB12transporters:LMBD1andABCD4[J].MolMembrboil.2014Nov,31(7-8):250-261[10]J.P.Landry,YaohuangKe,Guo-LiangYu,X.D.Zhu,Measuringaffinityconstantsof1450monoclonalantibodiestopeptidetargetswithamicroarray-basedlabel-freeassayplatform,JournalofImmunologicalMethods,Availableonline20December2014,ISSN0022-1759[11]HuangY,ZhangY,ZhaoB,XuQ,ZhouX,SongH,YuM,MoW.StructuralbasisofRGD-hirudinbindingtothrombin:Tyr3andfiveC-terminalresiduesarecrucialforinhibitingthrombinactivity[J].BMCStructBiol,2014Dec20,14(1):26[12]宋熙熙,邵爽,雷群芳,等.等溫滴定量熱法測定脲酶催化尿素水解反應動力學[J].浙江大學學報:理學版,2009,36(2):175-179[13]GhaiR,FalconerRJ,CollinsBM.Applicationsofisothermaltitrationcalorimetryinpureandappliedresearch—surveyoftheliteraturefrom2010[J].JournalofMolecularRecognition,2012,25(1):32-52[14]王雪松,杜為紅,王保懷.淀粉樣蛋白聚集纖維化的抑制作用研究[J].中國科學:化學,2014,06:822-830[15]楊少梅,侯瑾,黃志寧等.紫杉醇與人血清白蛋白的相互作用[J].廈門大學學報（自然科學版）,2014,53(4):581-587[16]楊炳君.碲化鎘量子點對原代肝、腎細胞及氧化應激蛋白質(zhì)的毒性研究[D].山東大學,2014[17]AndrasiM,LehoczkiG,NaqyZ,GasparA.Acomparativestudyofcapillaryelectrophoresisand

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