測序峰圖測序方法現(xiàn)代DNA序列測序可分為一二三代。一代測序第一代測序技術(shù)包括鏈終止法和化學降解法，其主要特點是以待測DNA為模板，根據(jù)堿基互補規(guī)那么采用DNA聚合酶體外合成新鏈。由于新鏈中滲入了帶有標記的堿基類似物，可用于制備末端帶有標記的DNA單鏈。這些末端帶有標記的DNA單鏈是一個群體，在凝膠電泳時可以形成彼此僅差一個堿基的梯形條帶。根據(jù)末端堿基的特有標記可以讀取待測DNA的序列組成。鏈終止法〔Sanger法〕反響分別在4個試管中進行，每一試管中都含有：待測的DNA單鏈片段，作為模板；DNA聚合酶；序列且與模板3'端互補的引物；四種脫氧核苷三磷酸(dATP、dGTP、dCTP和dTTP)；四種雙脫氧核苷酸中的一種，作為DNA鏈合成的末端終止劑。在適當條件下進行互補鏈的合成，由于新?lián)饺氲暮塑账嶂荒芡律?’端的-OH連接，而2’,3’-雙脫氧核苷三磷酸核糖基的2’,3’位-OH的氧已脫掉，失去了和后來的核苷酸連接的可能性，這時堿基的摻入就有兩種可能性：dNTP摻入新生鏈，使鏈繼續(xù)延伸。2’,3’-ddNTP摻入，使新生鏈的合成終止。由于兩者摻入的幾率不同，就形成一套長度不一的DNA片段。最后通過A、T、G和C四組反響的凝膠電泳放射自顯影圖譜，即可讀出所測樣品互補鏈的核苷酸序列。引自Molecularbiology5引自Molecularbiology5thedition,Weaver引自ThemethodsofDNAsequencing,WestOneServices要求測序時使用的DNA聚合酶不能有5’-3’外切酶活性〔可將新合成DNA鏈的5’-末端除去核苷酸而改變鏈的長度〕、3’-5’外切酶活性〔可將錯配的堿基除去，再補上正確配對的核苷酸〕。這兩種活性會產(chǎn)生干擾條帶。引自引自《基因組學第三版》，楊金水熒光染料標記物在Sanger法中的應(yīng)用目前已發(fā)現(xiàn)具有不同熒光色彩的標記化合物，可將其分別與指定的ddNTP結(jié)合，如ddATP標記綠色熒光，ddCTP藍色熒光，ddTTP紅色熒光，ddGTP黑色熒光。這四種標記的ddNTP混合參加到一個反響中，聚合鏈終止反響完成后，可以獲得末端分別帶有A、C、T和G的DNA單鏈。毛細管電泳帶電粒子在電場力的驅(qū)動下，在毛細管中按其分配系數(shù)不同進行高效、快速別離的電泳技術(shù)。引自引自互動百科引自Molecularbiology引自Molecularbiology5thedition,Weaver測序峰圖峰圖是以4種顏色連續(xù)的峰型圖代表A、T、G、C4種堿基序列的圖。峰的上下說明了信號的強弱，寬窄表示的是別離效果，可以比照板膠電泳的亮度和條帶的寬窄。重疊那么說明了樣品中有長度相同但是序列不同的片段。概念：讀長：序列讀取的堿基長度，峰圖上方橫向顯示的數(shù)字。信號：測序序列是通過對不同堿基所攜帶的不同顏色的熒光信號翻譯所得，熒光信號的強弱是我們常說的信號。成功峰圖？峰型：鋒利、對稱、無底峰；讀長：800bp可信；信號：正?！?k~20k〕，走勢平緩下降。測序峰圖中可能存在的問題此此局部峰型圖由華大基因〔BGI〕提供。峰型問題可信讀長問題信號問題雙峰非單克隆特征：從插入位點開始雙峰或某個位置開始雙峰。處理方法：重新挑單克隆測序。雜合〔突變〕特征：峰圖中某些位置雙峰。FigureSEQFigure\*ARABIC1SNPFigureSEQFigure\*ARABIC2雜合缺失特征：從堿基缺失位置出現(xiàn)移碼。移碼-----底峰序列表現(xiàn)為主峰向左或向右移動后的序列。引物問題(YM)：引物合成不純或降解特征：序列一開始就出現(xiàn)移碼現(xiàn)象處理方法：重新合成引物再測序結(jié)合問題(JH)特征：〔1〕一開始就是雙峰，在某一點終止或從頭到尾雙峰可能原因：模板上有2個或2個以上以上引物結(jié)合位點、模板或引物不純。處理方法：重新制備樣品或設(shè)計特異引物測序夾峰：模板量高特征：峰圖中兩峰之間夾有小雜峰，一般不影響主峰的讀取，在信號圖中表現(xiàn)為反響信號過高。處理方法：直接或稀釋重跑，降低模板量測序?qū)挿蹇赡茉颍耗０宀患兓騊OP7膠中有氣泡處理方法：重跑底峰不干凈特征：信號圖中基線不齊或信號弱可能原因：模板純度不好，有雜質(zhì)；模板量偏低或反響進行不充分處理方法：重新純化或重送樣；加量重做或重送樣引物峰及引物二聚體峰特征：在20-30、40-60bp堿基處有高信號的峰形成，之后信號可能衰減。處理方法：重新合成引物或重新設(shè)計引物測序。引物形成二聚體致使反響無信號干擾峰〔染料峰〕和酒精峰特征：4個干擾峰固定出現(xiàn)在30、40、70、110bp附近。處理方法：重新測序降解峰特征：在220、450bp附近G堿基降解，峰型擴散。處理方法：假設(shè)不影響堿基判讀不安排調(diào)整，否那么安排重新測序。重復序列〔CF〕特征：單堿基或兩個以上堿基重復出現(xiàn)，導致后續(xù)峰圖可能移碼或亂峰。處理方法：因重復未測到的序列，建議加測反向補拼。高GC〔GC〕特征：序列局部堿基GC富集，之后可能信號衰減，峰圖變亂?；匚慕Y(jié)構(gòu)及其他結(jié)構(gòu)〔JG〕特征：信號衰減或中斷，峰圖變亂。處理方法：最好選用GC優(yōu)化程序。無信號特征：峰圖表現(xiàn)為雜亂無章。形成原因：引物和模板不能正常結(jié)合反響，包括漏加，加錯，有影響結(jié)合或影響反響因素。處理方法