紫貽貝在大連海域的自?xún)粼囼?yàn)

麻痹性核毒（psp）是目前已知的海洋藻類(lèi)毒素中毒性物質(zhì)的一種較常見(jiàn)的藥物類(lèi)型，對(duì)人類(lèi)影響最大。它通常分布在世界沿海地區(qū)。中國(guó)是受麻痹性核毒影響嚴(yán)重的國(guó)家之一。它不僅給當(dāng)?shù)匮睾ｐB(yǎng)殖帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，而且給人們的健康帶來(lái)了巨大的威脅。PSP是一類(lèi)四氫嘌呤類(lèi)物質(zhì),堿性,易溶于水,微溶于甲醇、乙醇,在酸性條件下熱穩(wěn)定,但在堿性條件下易被氧化。根據(jù)結(jié)構(gòu)的不同可分為四類(lèi):氨基甲酸酯類(lèi)毒素(carbamatetoxins),包括石房蛤毒素(STX)、新石房蛤毒素(neoSTX)、膝溝藻毒素1-4(GTX1-4);N-磺酰氨甲?；?lèi)毒素(N-sulfo-carbamoyltoxins),包括B1/B2,C1-4;脫氨甲酰基類(lèi)毒素(decarbamolytoxins),包括dcSTX、dcneoSTX、dcGTX1-4;脫氧脫氨甲?；?lèi)毒素(deoxydecarbamoyltoxins),包括dcSTX、dcGTX2/3。紫貽貝能夠快速積累PSP,相比其他雙殼貝類(lèi),其對(duì)PSP的排出速度也較為迅速。通過(guò)將紫貽貝轉(zhuǎn)移到清潔水體中的方法使其達(dá)到自?xún)舻男Ч梢杂行У亟档蚉SP在其體內(nèi)的聚集,從而解決紫貽貝衛(wèi)生質(zhì)量問(wèn)題。1材料和方法1.1調(diào)節(jié)后吊養(yǎng)的細(xì)胞試驗(yàn)所用紫貽貝(Mytilusedulis)采自大窯灣海域(N39°09.98',E122°04.43'),清除體表臟物后用海水洗凈,放置于扇貝籠后吊養(yǎng)于大連棋盤(pán)磨海域中(N39°02.21',E122°17.82')。1.2方法1.2.1紫貽貝的采集此階段試驗(yàn)為期一個(gè)月,試驗(yàn)期間經(jīng)過(guò)測(cè)定海水平均溫度為11.2℃,鹽度31.8,pH7.5,DO10.9mg/L。每隔3d采取紫貽貝樣品,采樣的同時(shí)揀出死貝。每次取樣20粒,其中5粒取完整的軟體部做毒素分析,其余的15粒按器官解剖為閉殼肌、內(nèi)臟團(tuán)、鰓、外套膜、性腺5個(gè)部分,分別充分勻漿后于-20℃冰箱保存。1.2.2紫外區(qū)域高效液相色譜法測(cè)定紫貽貝pvc含量PSP的粗提:準(zhǔn)確稱(chēng)量2g貝類(lèi)組織于5mL離心管中,加入0.1mol/L鹽酸2mL,漩渦振蕩器混勻后用2mol/LHCl調(diào)節(jié)pH到3.0,煮沸5min后冷卻至室溫,再用2mol/LHCl或2mol/LNaOH溶液調(diào)節(jié)pH至2.0左右,然后以5000r/min離心10min,取上清液過(guò)0.22μm濾膜后分裝于安捷倫進(jìn)樣瓶中-20℃冰箱保存。高效液相色譜-熒光檢測(cè)法(highperformanceliquidchromatography-fluorescencedetection,HPLC-FLD)測(cè)定紫貽貝PSP含量:分析系統(tǒng)為Agilent1200series液相色譜工作站,通過(guò)熒光檢測(cè)器(FLD)來(lái)檢測(cè)洗脫峰;色譜柱為C18柱(250mm×4.6mm,5μm),熒光檢測(cè)器的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)分別設(shè)為330nm和390nm。色譜條件:GTX流動(dòng)相為4.3mmol/L庚基磺酸鈉+10mmol/L(NH4)3PO4(pH7.1);STX流動(dòng)相為2.0mmol/L庚基磺酸鈉+10mmol/L(NH4)3PO4(pH7.1),乙腈(體積比為20∶1);C毒流動(dòng)相1.0mmol/L四丁基磷酸銨(pH5.8);流速0.8mL/min,柱溫為40℃。氧化劑為10mmol/LH5IO6溶于50mmol/LK3PO4緩沖液中,pH9.0;酸化劑為0.5mol/L的CH3COOH,流速0.4mL/min,柱后衍生溫度為75℃。實(shí)驗(yàn)用水為屈臣氏蒸餾水,甲醇、乙腈、異丙醇等試劑均為色譜純。實(shí)驗(yàn)所用的PSP毒素標(biāo)準(zhǔn)品由加拿大海洋生物科學(xué)研究所(NRC)提供。配成三種混標(biāo)工作液:(1)C標(biāo)準(zhǔn)工作液:C1:5.7μmol/L、C2:1.75μmol/L;(2)GTX標(biāo)準(zhǔn)工作液:GTX1:2.65μmol/L、GTX2:2.95μmol/L、GTX3:0.975μmol/L、GTX4:0.875μmol/L、GTX5:1.625μmol/L、dcGTX2:2.85μmol/L、dcGTX3:0.8μmol/L;(3)STX標(biāo)準(zhǔn)工作液:neo-STX:6.5μmol/L、dcSTX:6.2μmol/L、STX:6.5μmol/L。2結(jié)果與討論2.1麻醉性貝毒的富集與釋放特性紫貽貝軟體部中PSP成分包括膝溝藻類(lèi)毒素GTX2/3和N-磺酰氨甲酰基類(lèi)毒素C1/C2四種組分。在自然條件下紫貽貝軟體部PSP排出速度較快(圖1),在第4d毒素就降低到了很低的水平,尤其是膝溝藻類(lèi)毒素GTX2/3在第4d時(shí)已經(jīng)全部排出,C1排出了79.92%,在第16d時(shí)全部排出;C2排出了89.58%,在第13d時(shí)完全排出,排出速度為:GTX3>GTX2>C2>C1。作為前哨種的貽貝屬(Mytilusspp.)相對(duì)于其他雙殼貝類(lèi),具有中毒早、毒素吸收率高、毒素積累水平高、排毒迅速的特點(diǎn)。Bricelj等對(duì)紫貽貝PSP吸收動(dòng)力學(xué)研究,他們用高毒性的塔瑪亞歷山大藻投喂紫貽貝,貝體在該環(huán)境下暴露1h其體內(nèi)毒素水平就能達(dá)到并超過(guò)食用安全標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)限(80μgSTXeq/100g)。其中肌肉、外套膜、鰓、和足中顯著富集了STX,相對(duì)GTX2/3和neoSTX的量較少。本試驗(yàn)中軟體部的主要成分為GTX2/3和C1/2,其原因在于自然條件下紫貽貝攝食食物的組成不同,天然海域中有毒藻類(lèi)的種類(lèi)多種多樣,也就決定了貝類(lèi)體內(nèi)所富集毒素的多樣性。天然海區(qū)中麻痹性貝毒總毒素的變化趨勢(shì)由高到低,在第13d時(shí)基本達(dá)到最低,其后基本不再變化。這可能因?yàn)樽匀淮蟓h(huán)境下,營(yíng)養(yǎng)水質(zhì)等條件變化較小,外界環(huán)境基本穩(wěn)定的結(jié)果,因此紫貽貝可能會(huì)達(dá)到一種平衡的解毒模式,體內(nèi)的麻痹性毒素緩慢平穩(wěn)的凈化或釋放到體外,不同的營(yíng)養(yǎng)條件下,紫貽貝會(huì)采取不同的凈化途徑或模式,比如在體內(nèi)凈化轉(zhuǎn)化為其它的毒性大的結(jié)構(gòu)組分,會(huì)導(dǎo)致總毒素的增加,而且不同的組分結(jié)構(gòu)對(duì)不同的營(yíng)養(yǎng)條件的選擇性可能會(huì)不同,在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,neo-STX與總毒素含量呈現(xiàn)基本一致的趨勢(shì),說(shuō)明這一組分結(jié)構(gòu)的累積產(chǎn)生趨勢(shì)對(duì)環(huán)境條件變化比較敏感;而C1和C2毒素組分在試驗(yàn)過(guò)程中具有相同的變化累積趨勢(shì),因此這兩種組分在不同的環(huán)境條件下具有基本相同的產(chǎn)生變化規(guī)律或模式。2.2消化腺中cod及wolbachima的變化紫貽貝消化腺PSP含量最高,為軟體部的5.36倍。其組分組成較為復(fù)雜(圖2),包括:C1、C2、dcGTX2、GTX3、GTX5、GTX2和neo-STX等多種組分。這一結(jié)果與Bricelj等的結(jié)果一致,PSP在紫貽貝體內(nèi)累積達(dá)到飽和后,紫貽貝的消化腺中貯有攝入毒素總量的79%,且消化腺中的毒素組成與被攝食藻類(lèi)的毒素組成十分相似。在為期一個(gè)月的解毒實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,消化腺中毒素成分及含量發(fā)生了復(fù)雜的變化,總毒素含量從154.68μgSTXeq/100g下降到0.24μgSTX-eq/100g,各組分的變化也各有差異(圖3)。在解毒實(shí)驗(yàn)過(guò)程中neo-STX的含量在第3d時(shí)上升為128.23μgSTXeq/100g,第7d降為0.00μgSTX-eq/100g,各組分的降解速度為:GTX3(6.94μgSTXeq/100g·d)>neo-STX(6.31μgSTXeq/100g·d)>GTX5(4.19μgSTXeq/100g·d)>dcGTX2(2.33μgSTXeq/100g·d)>GTX2(2.13μgSTXeq/100g·d)>C2(0.38μgSTXeq/100g·d)>C1(0.26μgSTXeq/100g·d)。該試驗(yàn)過(guò)程中第4d消化腺中neo-STX的含量增加了90.39μgSTXeq/100g,而其他各組分降解的總毒素量卻只有66.82μgSTXeq/100g,其原因一部分可歸因于紫貽貝消化腺中有毒藻破裂后毒素釋放的結(jié)果,因在該海區(qū)并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)有毒藻赤潮的藻類(lèi)及包囊,所以排除了外源性麻痹性貝毒通過(guò)攝食作用的可能。另一部分可歸因于PSP各種毒素之間的相互轉(zhuǎn)化。Oshima在進(jìn)行PSP毒素的研究時(shí)發(fā)現(xiàn),貝體內(nèi)的毒素存在著相互轉(zhuǎn)化,轉(zhuǎn)化主要包括兩種類(lèi)型,即化學(xué)轉(zhuǎn)化和酶促轉(zhuǎn)化。大致為C1、C2可轉(zhuǎn)化為B1、GTX3;GTX2可轉(zhuǎn)化為GTX3、STX;neo-STX可轉(zhuǎn)化為STX;dcSTX可由B1和STX轉(zhuǎn)化而來(lái);GTX1、4可由C3、C4轉(zhuǎn)化而來(lái)。2.3dna及體外毒副反應(yīng)中nano、co、nd紫貽貝閉殼肌中PSP組分組成相對(duì)單一,僅含有C1、C2和neo-STX三種成分。其中neo-STX占了94.21%,且neo-STX毒素含量變化與C1和C2的毒素含量變化相反,C1和C2組分均能在第10d全部排出,而neo-STX毒素含量在解毒試驗(yàn)期間是增加的,到試驗(yàn)結(jié)束時(shí)毒素含量增加了91.40%(表1)。周弘農(nóng)等曾對(duì)西施舌進(jìn)行了PSP的積累和解毒實(shí)驗(yàn)研究,其解毒期間GTX1組分有短期上升,他將其一部分歸因于西施舌吞食了沉淀物中的有毒藻孢囊,另一部分歸因于由消化腺中毒素的轉(zhuǎn)化。而本試驗(yàn)中紫貽貝吊樣的凈化海域中并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)有毒藻的包囊,所以閉殼肌中ne