日糧添加甘露寡糖對(duì)肉仔雞腸道菌群穩(wěn)定性及多樣性的影響

胃是動(dòng)物體消化的重要場(chǎng)所。維持腸道健康是確保動(dòng)物身體正常生長(zhǎng)的關(guān)鍵。腸道微生物區(qū)域的穩(wěn)定和平衡對(duì)確保腸道健康起著重要作用。腸道微生物通過(guò)釋放某些生物活動(dòng)物質(zhì)或間接激活腸道信息系統(tǒng)，影響球孢菌的生長(zhǎng)和腸道粘膜的完整性，對(duì)整個(gè)身體的營(yíng)養(yǎng)和免疫起著重要作用。隨著微生物技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的腸道微生物被發(fā)現(xiàn)和培育。到目前為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了400多種不同大小的微生物。由于實(shí)驗(yàn)條件的限制，過(guò)去的腸道微生物研究主要通過(guò)傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)方法來(lái)限制腸道微生物區(qū)域的真實(shí)性。隨著16srr多樣性方法的發(fā)展和應(yīng)用，人們可以快速、準(zhǔn)確地了解腸道微生物區(qū)域的變化。甘露寡糖(mannose-oligosaccharides,MOS)又稱甘露低聚糖或葡甘露寡聚糖.作為一種新型微生態(tài)添加劑,MOS用量少、純天然、無(wú)殘留且穩(wěn)定性強(qiáng),同時(shí)還具有吸附腸道病原菌和發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的雙重功效,能夠提高動(dòng)物機(jī)體抗病能力,從而提高動(dòng)物的生產(chǎn)性能,被認(rèn)為是抗生素強(qiáng)有力的潛在替代品.早在1989年就有人證實(shí)了日糧中添加MOS能夠成功抑制有害菌在肉雞腸道中的定殖.本試驗(yàn)利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)肉仔雞生長(zhǎng)過(guò)程中腸道微生物區(qū)系發(fā)育進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究,并重點(diǎn)探討了日糧中添加MOS對(duì)肉仔雞腸道微生物區(qū)系發(fā)育的影響,為進(jìn)一步認(rèn)識(shí)MOS及其推廣應(yīng)用提供一定的理論依據(jù).1材料和方法1.1股份有限公司財(cái)務(wù)風(fēng)險(xiǎn)1日齡AA肉雞購(gòu)至安徽和威農(nóng)業(yè)開(kāi)發(fā)股份有限公司;試驗(yàn)所用美國(guó)奧特奇公司生產(chǎn)的甘露寡糖(奧奇素,Bio-MOS)由南京禾嘉牧業(yè)有限公司提供.1.2日糧基礎(chǔ)飼草料選擇體質(zhì)量基本一致的1日齡健康A(chǔ)A肉仔雞192羽,隨機(jī)分為2組:Ⅰ組(對(duì)照組:飼喂基礎(chǔ)日糧);Ⅱ組(前期:飼喂基礎(chǔ)日糧+0.2%Bio-MOS;后期:飼喂基礎(chǔ)日糧+0.1%BioMOS).每組96只,4個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)24羽.試驗(yàn)期為42d.1.3.2.4飼養(yǎng)管理肉雞基礎(chǔ)日糧組成和營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1,試驗(yàn)用料為粉料.試驗(yàn)肉雞飼養(yǎng)于同一雞舍中,采用層疊籠養(yǎng),自由采食和飲水,24h光照,免疫程序及其他飼養(yǎng)管理按常規(guī)進(jìn)行.試驗(yàn)地點(diǎn)為南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院動(dòng)物房.1.4雞腸段內(nèi)容物的制備分別于7、14、21、28、35和42日齡每組隨機(jī)取體質(zhì)量相近的12只雞宰殺,剖開(kāi)腹腔,分別結(jié)扎肌胃、十二指腸、空腸、回腸和盲腸,無(wú)菌條件下取腸段內(nèi)容物,置于冰塊上.將同組12只雞各腸段內(nèi)容物等量混合均勻,分裝,-20℃保存.1.5提取細(xì)菌總dna參照Z(yǔ)oetendal等的方法,用珠磨法機(jī)械破碎樣品,而后再用酚和V(氯仿)∶V(異戊醇)=24∶1提取腸道食糜總DNA.1.6pcr擴(kuò)增條件對(duì)細(xì)菌16SrDNA的V6-V8區(qū)段進(jìn)行PCR擴(kuò)增.上游引物為帶GC夾子的U968,下游引物為L(zhǎng)1401.上述引物均由上海英駿公司合成.PCR擴(kuò)增條件:94℃預(yù)變性4min;94℃變性20s,56℃退火20s,68℃延伸40s,35個(gè)循環(huán);最后68℃延伸7min.PCR產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)片段大小和濃度,-20℃冰箱保存?zhèn)溆?1.7srrna基因多態(tài)性電泳參照Muyzer等的方法,對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DGGE分析.DGGE用8%聚丙烯酰胺凝膠(含丙酰胺、二丙酰胺、尿素、甲酰胺和甘油),對(duì)16SrRNA基因的V6~V8可變區(qū)片段進(jìn)行電泳,尿素濃度梯度為35%~55%,電泳采用DcodeDGGE系統(tǒng)(Bio-Rad).1.8帶的特定序列的測(cè)量和分析1.8.1dna提取和純度將EB染色的DGGE膠片置于紫外燈下,切下不同位置的條帶,分別放入1.5mL離心管中,用DNA回收試劑盒進(jìn)行DNA回收和純化.1.8.2序列測(cè)量1.9pcr-dppe電泳圖譜的聚類(lèi)分析使用QuantityOne(Bio-Rad)分析軟件包對(duì)PCR-DGGE電泳圖譜進(jìn)行條帶計(jì)數(shù),用非加權(quán)成對(duì)算術(shù)平均數(shù)(unweightedpairgroupmeanaverage,UPGMA)進(jìn)行聚類(lèi)分析.2結(jié)果與分析2.1不同日齡雞腸道微生物多樣性的變化圖1為7、14、21、28、35和42日齡AA肉仔雞肌胃、十二指腸、空腸、回腸和盲腸內(nèi)容物菌群16SrDNAV6-V8區(qū)PCR-DGGE圖譜.結(jié)果表明,肉仔雞消化道不同部位微生物的組成不盡相同,優(yōu)勢(shì)條帶大都位于圖譜偏下的位置,主要為L(zhǎng)actobacillussalivarius(唾液乳酸桿菌)、Lactobacillusjohnsonii(約漢遜氏乳酸桿菌)、Lactobacilluscrispatus(卷曲乳酸桿菌)和Lactobacillusgasseri(加氏乳酸桿菌)(表2).隨著日齡變化,各消化道中的一些優(yōu)勢(shì)條帶也隨之改變.7日齡時(shí),Coprococcuscomes(陪伴糞球菌)和Ruminococcuslactaris(酸奶瘤胃球菌)同為十二指腸中的優(yōu)勢(shì)菌,盲腸中細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)性不明顯.14日齡時(shí),Lactobacillusgasseri(加氏乳酸桿菌)開(kāi)始在盲腸中占優(yōu)勢(shì)地位.28日齡時(shí),回腸中出現(xiàn)了新的優(yōu)勢(shì)菌———Clostridiumbartlettii(梭菌屬),但至35日齡消失.42日齡時(shí),十二指腸中檢測(cè)出2株新的菌株,即Clostridiumbartlettii(梭菌屬)和Ruminococcusgnavus(活潑瘤胃球菌),而盲腸的優(yōu)勢(shì)菌則變?yōu)镽uminococcusobeum(卵瘤胃球菌)和Carnobacteriumsp.(肉桿菌屬),各消化道微生物區(qū)系基本成形.對(duì)于PCR-DGGE方法來(lái)說(shuō),圖譜的條帶數(shù)反映了整個(gè)菌群的多樣性.圖2結(jié)果表明,盲腸內(nèi)微生物種類(lèi)在不同日齡肉雞中表現(xiàn)最為豐富,其次是回腸、空腸,肌胃和十二指腸中細(xì)菌種類(lèi)相對(duì)較少.1~21日齡時(shí),肌胃、十二指腸、空腸、回腸和盲腸內(nèi)容物中微生物的多樣性隨日齡的增加而呈上升趨勢(shì),盲腸中的條帶數(shù)最多;而28日齡時(shí),各消化道部位的多樣性均較21日齡有所下降;試驗(yàn)后期,十二指腸和回腸的微生物多樣性仍隨日齡上升,肌胃和空腸的微生物多樣性在35日齡時(shí)出現(xiàn)峰值,盲腸則是在35日齡時(shí)出現(xiàn)了低谷,28、42日齡都較其豐富.對(duì)DGGE電泳結(jié)果進(jìn)行UPGMA相似性聚類(lèi)分析的結(jié)果(圖3)表明:各日齡泳道之間帶譜相似性較差,其中盲腸各日齡間的相似性最高只達(dá)到63%,最低只有18%;肌胃中帶譜相似性普遍高于其他消化道,最高也只達(dá)到了77%.這也表明,消化道越接近遠(yuǎn)端,各日齡間微生物區(qū)系的相似性就越低.2.2不同菌株在肌胃中的菌群變化圖1、圖2結(jié)果表明,飼喂MOS后,肉仔雞各日齡段、各消化道的微生物區(qū)系出現(xiàn)了不同的變化,主要集中在生長(zhǎng)前期,并且各消化道微生物群落的豐度并沒(méi)受太大影響,肌胃中的微生物區(qū)系基本沒(méi)有變化.7日齡時(shí),MOS促進(jìn)了空腸中Lactobacillussalivarius(唾液乳酸桿菌)的生長(zhǎng),抑制了回腸中Streptococcussuis(豬鏈球菌)的生長(zhǎng),同時(shí)還促進(jìn)了盲腸中Lactobacillusgasseri(加氏乳酸桿菌)的生長(zhǎng).14日齡時(shí),對(duì)照組十二指腸中Lactobacillusjohnsonii(約漢遜氏乳酸桿菌)和Lactobacillussalivarius(唾液乳酸桿菌)都是優(yōu)勢(shì)菌群,而MOS組只有Lactobacillussalivarius(唾液乳酸桿菌)1種優(yōu)勢(shì)菌群;空腸、回腸和盲腸的菌群沒(méi)有明顯變化.28日齡時(shí),MOS組各腸道的優(yōu)勢(shì)菌群沒(méi)有改變,但MOS消除了空腸中的Ruminococcussp.(瘤胃球菌屬),并增加了回腸中Streptococcussuis(豬鏈球菌)和盲腸中Lactobacillusgasseri(加氏乳酸桿菌)的數(shù)量.35日齡時(shí),十二指腸、空腸和回腸的菌群沒(méi)有明顯變化,但MOS減少了盲腸中Ruminococcusobeum(卵瘤胃球菌)和Carnobacteriumsp.(肉桿菌屬)的數(shù)量.42日齡時(shí),MOS削弱了Clostridiumbartlettii(梭菌屬)和Ruminococcusgnavus(活潑瘤胃球菌)這2種菌在十二指腸以及空腸中Lactobacillussalivarius(唾液乳酸桿菌)的優(yōu)勢(shì)性;同時(shí)MOS增加了Clostridiumbartlettii(梭菌屬)在回腸中的數(shù)量,取代了Lactobacillussalivarius(唾液乳酸桿菌)的優(yōu)勢(shì)性;對(duì)于盲腸的菌群結(jié)構(gòu),MOS沒(méi)有明顯變化.圖3結(jié)果表明,空白組各日齡間肌胃中菌群相似性最高達(dá)77%,十二指腸最高為68%,空腸最高為72%,回腸最高為49%,盲腸最高為63%;MOS組與空白組相比較,肌胃、十二指腸、空腸、回腸和盲腸中相似性最高分別達(dá)76%、84%、72%、49%和63%.這說(shuō)明,日糧中添加MOS會(huì)對(duì)肉雞的腸道菌群產(chǎn)生影響,但是日齡的變化仍是影響腸道微生物區(qū)系的主要因素.3腸道微生物的模擬大量研究表明,不同個(gè)體之間腸道菌群存在很大差異.即使處于同一飼養(yǎng)環(huán)境中,日齡和日糧均相同,對(duì)腸道微生物帶譜的檢測(cè)都會(huì)有所不同.為了能夠反映各處理間腸道微生物的真實(shí)情況,樣本大小(雞只的數(shù)量)非常關(guān)鍵.Zhou等利用PCR-DGGE技術(shù)研究了分別混合2~15只雞腸道樣品后圖譜的差異性,發(fā)現(xiàn)當(dāng)對(duì)5個(gè)以上的個(gè)體樣本進(jìn)行混合時(shí),PCR-DGGE圖譜有很大的相似性,能夠代表整體的菌群組成.為了減小個(gè)體之間差異對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響,本試驗(yàn)中,各組取12只雞分別將其肌胃、十二指腸、空腸、回腸和盲腸內(nèi)容物混合后提取細(xì)菌總DNA,可保證結(jié)果不受個(gè)體差異的影響,具有代表性.3.1微生物的來(lái)源由于家禽消化道不同部位的生理環(huán)境不同,使得各部分間微生物區(qū)系存在一定特異性.vanderWielen等研究表明,肉雞嗉囊、十二指腸、遠(yuǎn)端回腸和盲腸中微生物區(qū)系的多樣性隨著日齡的增長(zhǎng)而增加.同時(shí)Knarreborg等還表明,肉雞回腸中微生物區(qū)系的組成隨著日齡的變化而變化.本試驗(yàn)結(jié)果表明,從整體趨勢(shì)上來(lái)看,隨著日齡的變化,各消化道的微生物區(qū)系也由簡(jiǎn)單向復(fù)雜發(fā)展.并且不同消化道之間的菌群多樣性存在一定差異,盲腸中微生物的多樣性在不同日齡肉雞中表現(xiàn)最為豐富,這與Zhu等的研究結(jié)果相似.其次是回腸、空腸,肌胃和十二指腸中細(xì)菌種類(lèi)相對(duì)較少.肌胃內(nèi)的微生物主要來(lái)源于飼料,細(xì)菌的種類(lèi)和數(shù)量較低;十二指腸內(nèi)的環(huán)境不利于細(xì)菌生長(zhǎng),所以DGGE圖譜較簡(jiǎn)單.這與傳統(tǒng)培養(yǎng)方法的檢測(cè)結(jié)果相似,vanderWielen等和Gong等也有類(lèi)似報(bào)道.對(duì)肉仔雞各消化道PCR-DGGE圖譜特異性和共性條帶的測(cè)序結(jié)果進(jìn)一步證明了消化道不同部位對(duì)菌群組成的影響.傳統(tǒng)培養(yǎng)方法已經(jīng)證實(shí)肉仔雞腸道內(nèi)優(yōu)勢(shì)菌群的數(shù)量會(huì)隨年齡增長(zhǎng)而增加.消化道前段的優(yōu)勢(shì)菌群主要是乳酸桿菌類(lèi),活菌含量在1×107cfug-1左右,主要由1~3種乳酸桿菌組成.本試驗(yàn)中,肌胃、十二指腸、空腸、回腸和盲腸各日齡段的優(yōu)勢(shì)菌群主要為L(zhǎng)actobacillussalivarius(唾液乳酸桿菌)、Lactobacillusjohnsonii(約漢遜氏乳酸桿菌)、Lactobacilluscrispatus(卷曲乳酸桿菌)和Lactobacillusgasseri(加氏乳酸桿菌),與上述報(bào)道相符.同時(shí)在這些消化道部位還分別檢測(cè)到其他菌種的定殖,也說(shuō)明傳統(tǒng)的培養(yǎng)技術(shù)存在很大的局限性,不能真實(shí)還原整個(gè)腸道微生態(tài)環(huán)境.Amit-Romach等分別對(duì)肉仔雞4、14、25日齡的腸道菌群進(jìn)行檢測(cè)后發(fā)現(xiàn),幼年時(shí)期,存在于肉仔雞小腸和盲腸中的主要菌群為乳酸桿菌,而隨著日齡的增加,雙歧桿菌在盲腸中變得更占優(yōu)勢(shì),但本試驗(yàn)中,雙歧桿菌屬在盲腸內(nèi)并沒(méi)有優(yōu)勢(shì)條帶出現(xiàn),由于DGGE方法自身的限制性,如果某一菌屬的含量低于總體水平的1%,那么很可能在圖譜上就不能夠反映出來(lái),說(shuō)明雙歧桿菌在盲腸中的含量比較少或不能在盲腸內(nèi)定殖.3.2不同菌株對(duì)腸道微生物的影響從本試驗(yàn)中可以看出,日糧中添加MOS對(duì)十二指腸、空腸、回腸和盲腸中微生物區(qū)系都有不同程度的改變.這些消化道中受影響的菌屬主要包括:Lactobacillusgasseri(加氏乳酸桿菌)、Lactobacillusjohnsonii(約漢遜氏乳酸桿菌)、Lactobacillussalivarius(唾液乳酸桿菌)、Coprococcuscomes(陪伴糞球菌)、Ruminococcuslactaris(酸奶瘤胃球菌)和Clostridiumbartlettii(梭菌屬).MOS能夠與具有Ⅰ型菌毛(甘露糖敏感性外源凝集素)的病原菌和潛在致病菌結(jié)合,阻止其吸附在腸道黏膜上,打斷了病原菌附著-繁殖-致病的途徑,減少其在腸道定殖并誘發(fā)疾病的可能性,使