豬用精輸精管管腔中類(lèi)白喉柱狀桿菌的分離及培養(yǎng)特性研究

這種桿菌是一種中性綠色，形狀獨(dú)特，偶爾生長(zhǎng)在一側(cè)或兩端，通常是球形的、單帶和團(tuán)塊狀的桿菌。白喉?xiàng)U菌(Corynebacteriumdiphtheriae)為本屬代表菌,除了白喉?xiàng)U菌外,其他的棒狀桿菌一般統(tǒng)稱(chēng)為類(lèi)白喉棒狀桿菌(Diphthemidbacillus)。類(lèi)白喉棒狀桿菌形態(tài)類(lèi)似白喉?xiàng)U菌,菌體較短,多形性不顯著,培養(yǎng)特性及生化反應(yīng)有一定差異,主要包括假白喉?xiàng)U菌、干燥棒狀桿菌、腎棒狀桿菌、庫(kù)徹棒狀桿菌、假結(jié)核棒狀桿菌和牛棒狀桿菌等,與獸醫(yī)有關(guān)的類(lèi)白喉棒狀桿菌主要有腎棒狀桿菌、膀胱炎棒狀桿菌、纖毛棒狀桿菌、假結(jié)核棒狀桿菌、庫(kù)徹棒狀桿菌和牛棒狀桿菌等。類(lèi)白喉棒狀桿菌廣泛分布于自然界,正常情況下可寄居在人或動(dòng)物的鼻咽部、皮膚、黏膜和眼結(jié)膜等處,臨床證明其在多數(shù)情況下不具有致病性,但在宿主機(jī)體免疫力低下時(shí),類(lèi)白喉棒狀桿菌也會(huì)作為條件致病菌引起嚴(yán)重感染而導(dǎo)致敗血癥。有些中藥對(duì)類(lèi)白喉棒狀桿菌具有良好的抑菌效果,可以用于臨床因本菌感染而引起的敗血癥的治療。試驗(yàn)從豬用人工授精輸精管管腔中分離出Ⅰ株類(lèi)白喉棒狀桿菌,并進(jìn)行了鑒定,現(xiàn)報(bào)道如下。1培養(yǎng)基的制備豬用人工授精輸精管、普通瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、綿羊血脫纖瓊脂培養(yǎng)基、淀粉瓊脂培養(yǎng)基、普通肉湯培養(yǎng)基、各種糖(醇)等發(fā)酵管、普通瓊脂斜面培養(yǎng)基、尿素瓊脂斜面培養(yǎng)基、明膠培養(yǎng)基、普通培養(yǎng)基、酸性培養(yǎng)基、3%過(guò)氧化氫溶液,自制;藥敏紙片,市購(gòu);小白鼠[體重為(20.0±0.5)g],西北農(nóng)林科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。2方法2.1菌株的培養(yǎng)取豬用人工授精輸精管用無(wú)菌生理鹽水沖洗管腔2～3次,將沖洗后的生理鹽水接種于普通瓊脂培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng)48h;挑取疑似類(lèi)白喉棒狀桿菌菌落接種于普通瓊脂斜面,37℃培養(yǎng)48h以獲得純菌株。純菌株經(jīng)驗(yàn)純后于4℃冰箱保存,備用。2.2形態(tài)特征觀察對(duì)分離到的純菌株進(jìn)行抹片、革蘭染色、鏡檢,觀察并記錄形態(tài)特征;再將其接種于普通瓊脂、綿羊血脫纖瓊脂、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng)48h,觀察并記錄結(jié)果。2.3平板、尿素培養(yǎng)基將純菌株接種于各種糖(醇)等發(fā)酵管、淀粉瓊脂平板、尿素瓊脂斜面、明膠培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng)48～72h;在載玻片上滴2滴新配制的3%過(guò)氧化氫溶液,取少量菌株抹片,觀察結(jié)果。2.4不同ph值的培養(yǎng)試驗(yàn)將本菌株分別接種于普通培養(yǎng)基(pH值為7.5)和酸性培養(yǎng)基(pH值為6.3),37℃培養(yǎng)48h,觀察結(jié)果。2.5藥物過(guò)敏試驗(yàn)按參考文獻(xiàn)中介紹的紙片法對(duì)分離菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。2.6機(jī)構(gòu)間血清培養(yǎng)物的制備將分離到的第1代純菌株接種到普通肉湯培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng)48h。鏡檢驗(yàn)純后用麥?zhǔn)媳葷岱y(cè)菌株濃度,將8只小白鼠隨機(jī)分為4組,每組2只,雌雄各半:1～3組分別腹腔注射肉湯培養(yǎng)物,每組劑量分別為0.2,0.4,0.6mL;4(對(duì)照)組腹腔注射0.6mL無(wú)菌血清肉湯。觀察結(jié)果。將各組小白鼠頸椎脫臼致死,剖檢觀察各臟器有無(wú)病變,并無(wú)菌采集肝臟組織抹片,觀察結(jié)果。3結(jié)果3.1類(lèi)白喉網(wǎng)狀桿菌的鑒定從豬用人工授精輸精管管腔中分離、鑒定出1株細(xì)菌,經(jīng)生物學(xué)特性及生理生化檢驗(yàn)確定該菌株為類(lèi)白喉棒狀桿菌,與《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》報(bào)道的相符。3.2分離菌的形態(tài)分離菌為革蘭陽(yáng)性、中等大小桿菌,大小為(0.4～0.6)μm×(1.0～7.5)μm,且差異較大,最長(zhǎng)菌體約是最短菌體的7～8倍,大的呈長(zhǎng)絲狀,小的呈短桿狀,兩端鈍圓、膨大,無(wú)芽孢,單個(gè)或2～3個(gè)排列。分離菌在普通瓊脂培養(yǎng)基上形成微小菌落,圓形,表面光滑、濕潤(rùn),邊緣整齊,白色,呈針尖狀,不透明;在綿羊血脫纖瓊脂培養(yǎng)基上形成小菌落,圓形,表面光滑、濕潤(rùn),邊緣整齊,白色,呈針尖狀,不透明,不溶血。在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上于37℃培養(yǎng)48h不生長(zhǎng)。3.3生物化學(xué)試驗(yàn)的結(jié)果見(jiàn)表1根據(jù)生化試驗(yàn)結(jié)果并參考《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》,可確定分離菌為類(lèi)白喉棒狀桿菌。3.4不同ph值的培養(yǎng)分離菌在普通培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好,在酸性培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)。3.5藥物過(guò)敏試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表23.6分離后感染小鼠血清指標(biāo)經(jīng)麥?zhǔn)媳葷岱z測(cè),培養(yǎng)后的類(lèi)白喉棒狀桿菌的肉湯培養(yǎng)物菌株濃度為3×108/mL。腹腔注射后,試驗(yàn)組小白鼠均未出現(xiàn)發(fā)病癥狀,和對(duì)照組無(wú)差別,剖檢各臟器均正常。無(wú)菌采集肝臟組織塊在綿羊血脫纖瓊脂培養(yǎng)基上抹片,37℃培養(yǎng)48h后無(wú)本菌株生長(zhǎng),原因可能為本菌株被機(jī)體吞噬細(xì)胞所吞噬。4豬人工授精時(shí)菌株的致病性1)本次分離的菌株是從豬用人工授精輸精管管腔中分離,由于管腔內(nèi)部為相對(duì)清潔的環(huán)境,所含可供微生物生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)極少,在此環(huán)境中能存活,再加上對(duì)生物體最基本能量物質(zhì)碳水化合物不具有發(fā)酵作用,足以說(shuō)明分離菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求很低,在自然界中生存能力強(qiáng)。藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明,分離菌對(duì)大多數(shù)藥物都很敏感,對(duì)多種藥物不耐藥,說(shuō)明本菌株很可能來(lái)源于自然界。分離菌在普通瓊脂培養(yǎng)基和綿羊血脫纖瓊脂培養(yǎng)基上需培養(yǎng)48h以上才能見(jiàn)到肉眼可見(jiàn)的菌落,在普通肉湯中培養(yǎng)72h菌株濃度才能達(dá)到3×108/mL,表明其在普通培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)代謝緩慢。在酸性培養(yǎng)基中不生長(zhǎng)表明分離菌對(duì)酸敏感。動(dòng)物致病性試驗(yàn)結(jié)果表明,分離菌對(duì)動(dòng)物無(wú)致病作用,這與文獻(xiàn)報(bào)道的大多數(shù)類(lèi)白喉棒狀桿菌不具有致病性相一致。尿素酶試驗(yàn)的陽(yáng)性結(jié)果出現(xiàn)在60h以后,可能是分離菌對(duì)尿素的分解作用為遲緩反應(yīng),也可能是培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)細(xì)菌利用培養(yǎng)基中的蛋白類(lèi)物質(zhì)產(chǎn)堿而導(dǎo)致陽(yáng)性結(jié)果,具體原因有待進(jìn)一步研究考察。2)本次試驗(yàn)結(jié)果表明,市售豬用人工授精器械未經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的滅菌處理,輸精管管腔中殘留一些自然界常在菌,除了類(lèi)白喉棒狀桿菌外,本次試驗(yàn)還分離到了蠟狀芽孢桿菌,這些菌之所以在人工授精時(shí)未引起母豬感染,一是因?yàn)檫@些菌本身無(wú)致病性,為自然界常在菌,即使有機(jī)會(huì)入侵機(jī)體內(nèi)部,正常機(jī)體的免疫反應(yīng)也會(huì)將其吞噬清除,不會(huì)引起嚴(yán)重的感染;二是可能與人工授精時(shí)豬精液中含有一定量的抗菌物質(zhì)有關(guān),這些抗菌物質(zhì)有些是人工添加的抗生素,有些是精液原本就有的抗菌成分,在這些抗菌物質(zhì)作用下,輸精器械中的菌株可被抑制或殺死;另外,發(fā)情母豬陰道內(nèi)的酸性環(huán)境也對(duì)這些菌株有殺滅作用,從而保證在人工授精后不會(huì)引起感染。3)國(guó)內(nèi)張耀相等從豬化膿性干酪性關(guān)節(jié)炎病灶中分離到了化膿棒狀桿菌,證明此類(lèi)菌可引起豬關(guān)節(jié)炎。但總體上類(lèi)白喉棒狀桿菌在獸醫(yī)臨床上的報(bào)道很少,目前的研究主要集中在醫(yī)學(xué)臨床。在對(duì)血液樣本進(jìn)行檢驗(yàn)時(shí)可能會(huì)分離到類(lèi)白喉棒狀桿菌,但多數(shù)情況下檢驗(yàn)人員會(huì)誤認(rèn)為是抽血時(shí)污染所致,再加上此類(lèi)菌株大多數(shù)不致病而容易被忽略,最終導(dǎo)致患者病情加重。在治療方面,雖然很多資料顯示類(lèi)白喉棒狀桿菌對(duì)大多抗生素不具有耐藥性,但為了不耽誤患者病情,臨床最好以藥敏試驗(yàn)結(jié)果為用藥依據(jù),并配合其他輔助藥物從而提高