小麥制曲過程中的微生物種群結(jié)構(gòu)變化

小麥在黃酒的生產(chǎn)中發(fā)揮著非常重要的作用。由于其質(zhì)量的好壞，它直接影響到黃酒的產(chǎn)量和質(zhì)量。因此，小麥草有“酒的骨頭”的美譽。傳統(tǒng)的黃酒釀造采用的是自然固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)的生麥曲,以小麥為原料,通過網(wǎng)羅自然界中微生物,在堆放車間中進(jìn)行自然接種,使附著在小麥表面的微生物生長繁殖并代謝產(chǎn)生各種代謝產(chǎn)物。制曲過程也就是在微生物的參與下,發(fā)生著一系列的生物化學(xué)變化的過程。通常整個制曲過程根據(jù)麥曲品溫的變化分為6個階段:起始期(麥曲制作成型后堆放在曲房的第1天),發(fā)酵前期(麥曲進(jìn)入曲房的第2天),升溫期(第3天,微生物大量繁殖并開始產(chǎn)熱,麥曲品溫逐漸上升),高溫期(第4天,麥曲品溫達(dá)到最高溫度51～55℃,耐熱性差的微生物因高溫環(huán)境而失活死亡,而一些霉菌則停止生長,產(chǎn)生孢子),降溫期(第5～7天,及時的開窗通風(fēng)措施使得麥曲品溫逐漸回落),成熟期(培養(yǎng)至25～30天,麥曲品溫與室溫相近,麥曲中水分含量逐漸降低,微生物停止生長,麥曲已結(jié)成硬塊,即已成熟)。由于麥曲品溫和水分含量的變化,不同時期麥曲中參與發(fā)酵的微生物不同,所參與的反應(yīng)以及產(chǎn)酶情況也有所不同。目前對黃酒麥曲制曲過程的研究,一般多是通過酶活力的測定來研究制曲過程中主要水解酶系的活力變化,而對于這些同功酶的構(gòu)成及其來源等,往往不能進(jìn)行全面而有效的分析。在麥曲制曲過程中微生物群落的動態(tài)變化研究方面,目前主要是利用傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)鑒定結(jié)合分子生態(tài)學(xué)方法,如核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列分析(RISA)、變性梯度凝膠電泳(DGGE)。然而,利用這些方法所獲得的研究結(jié)果無法將麥曲中存在的特定微生物與其分泌的特定胞外酶聯(lián)系起來,從而達(dá)到深入理解黃酒麥曲固態(tài)發(fā)酵機理的目的。近幾年來迅速發(fā)展起來的宏蛋白質(zhì)組學(xué)理論和技術(shù)將可能解決這一問題。目前主要應(yīng)用于環(huán)境微生物生態(tài)系統(tǒng)研究的宏蛋白質(zhì)組學(xué),其定義是運用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對微生物群落進(jìn)行研究的一項新技術(shù),是從微生物群落的所有蛋白質(zhì)水平上直觀揭示復(fù)雜生態(tài)系統(tǒng)中微生物的功能及其變化。本研究利用宏蛋白質(zhì)組學(xué)的理論和方法,將麥曲樣品浸提液中所有可溶性蛋白定義為待研究的“宏蛋白質(zhì)組”,對麥曲制曲過程中的宏蛋白質(zhì)組動態(tài)變化情況進(jìn)行分析,所獲得的研究結(jié)果將有助于深入理解麥曲發(fā)酵過程機理。1材料和方法1.1材料表面1.1.1典型時期的樣品采集2010年夏秋,在紹興某黃酒廠制曲車間跟蹤兩批麥曲在制曲過程中的溫度和水分含量變化,分別采集第1天(起始期)、第2天(發(fā)酵前期)、3天(升溫期)、4天(高溫期)、6天(降溫期)和30天(成熟期)的麥曲,作為制曲過程中6個典型時期樣品。1.1.2蛋白定量試劑瓊脂糖、溴酚藍(lán)、二硫蘇糖醇(DTT)、碘乙酰銨(IAA)、固相IPG干膠條(18cm,pH3～10,非線性)、IPG緩沖液(pH3～10,非線性)、3-[(3-膽固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸(CHAPS)、N,N,N’,N’-四甲基乙二胺(TEMED)、尿素,為GE公司產(chǎn)品。IPG覆蓋液、RC-DC蛋白定量試劑盒,為Bio-Rad公司產(chǎn)品。Complete蛋白酶抑制劑混合片,為Roche公司產(chǎn)品。丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、十二烷基磺酸鈉(SDS)、過硫酸銨、考馬斯亮藍(lán)G-250、考馬斯亮藍(lán)R-250,為上海生工進(jìn)口分裝產(chǎn)品。甲醇、正丁醇、甘油、冰醋酸、磷酸、三氯乙酸(TCA)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、甘氨酸、丙酮、乙酸鈉、牛血清白蛋白,均為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。1.1.3儀器和檢測設(shè)備等電聚焦電泳儀EttanIPGphor3、EttanDALTsix垂直電泳系統(tǒng)和ImageScanner掃描儀,均為GE公司產(chǎn)品;CR22G型高速冷凍離心機,日本日立公司;Pico&Fresco17微量高速冷凍離心機,Thermo公司;UV-2100型紫外可見分光光度計,尤尼柯儀器有限公司;脫色搖床TS-1,海門市其林貝爾儀器公司。1.1.4dti不影響溴酚藍(lán)貯藏液樣品水化液:尿素4.8g,CHAPS0.4g,IPG緩沖液50μL,加入雙蒸水至總體積為10mL(使用前加入50mmol/LDTT)。平衡液I:尿素72.07g,SDS4.0g,1.5mol/LTris-HCl6.7mL(pH8.8),甘油69mL,1%溴酚藍(lán)貯存液400μL,加入雙蒸水至200mL,使用前每10mL加入DTT100mg。平衡液II:尿素72.07g,SDS4.0g,1.5mol/LTris-HCl6.7mL(pH8.8),甘油69mL,1%溴酚藍(lán)貯存液400μL,加入雙蒸水至200mL,使用前每10mL加入IAA250mg。1.2方法1.2.1樣品制備(1)comperte抑制劑溶液稱取25g麥曲,加入50mL0.1mol/L乙酸-乙酸鈉緩沖溶液(pH4.2)和1片Complete蛋白酶抑制劑混合片,在4℃條件下浸提過夜。然后依次用4層紗布過濾,濾液在12000r/min,4℃條件下離心30min,上清液即為麥曲浸提液。Bradford法測定蛋白含量。(2)蛋白沉淀和dtt法取一定量的麥曲浸提液,加入4倍體積的預(yù)冷丙酮溶液I(含20mmol/LDTT,10%TCA),搖勻,-20℃放置3h沉淀蛋白,之后4℃,12000r/min離心30min。棄上清液,收集沉淀。加入2mL預(yù)冷的丙酮溶液II(含20mmol/LDTT),-20℃放置1h,清洗沉淀,4℃,12000r/min離心15min。重復(fù)清洗2次。棄上清液,收集沉淀,然后置于-20℃冰箱中,使丙酮完全揮發(fā)。(3)麥曲宏蛋白質(zhì)組的檢測將干燥好的蛋白質(zhì)沉淀加入適量的樣品水化液,室溫下充分溶解,然后于12000r/min離心10min,上清液即為麥曲宏蛋白質(zhì)組樣品。RC-DC蛋白定量試劑盒測定蛋白含量。1.2.2ipgradint系聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)結(jié)構(gòu)及平衡按照GE公司《雙向電泳操作手冊》進(jìn)行水化上樣和等電聚焦。吸取350μL麥曲樣品水化液加入到膠條再泡脹盤中,取長度為18cm,pH3～10非線性的IPG干膠條水平放入其中,加入少量IPG覆蓋液,水化12h。水化過夜后的膠條轉(zhuǎn)移到EttanIPGphor膠條槽中,進(jìn)行等電聚焦。等電聚焦程序設(shè)置為:Step,50V×2h;Gradient,150V×2h;Gradient,250V×2h;Gradient,500V×2h;Gradient,1000V×2h;Gradient,5000V×2h;Gradient,10000V×2h;Step,10000V×40000Vh。等電聚焦結(jié)束后,立即進(jìn)行平衡。采用兩步平衡法,先將IPG膠條放入平衡液I中,在水平搖床上平衡15min,再使用平衡液II進(jìn)行第2步平衡,在搖床上平衡15min。平衡后進(jìn)行第二向SDS電泳,分離膠濃度為12.5%(26cm×21cm×1mm)。將平衡后的IPG膠條轉(zhuǎn)移到已聚合的聚丙烯酰胺凝膠膠面頂端,用0.5%的瓊脂糖封閉,排除膠條與膠面之間的氣泡。以恒功率方式進(jìn)行電泳:2W/根膠條,1.5h,然后調(diào)至16W/根膠條。凝膠染色、脫色:剝離凝膠,置于固定液(50%乙醇,10%乙酸)固定1h后,換到考馬斯亮藍(lán)染色液(0.025%考馬斯亮藍(lán)R-250,25%乙醇,10%乙酸)中染色4h,換脫色液(10%甲醇,10%乙酸)中脫色,直至背景為無色透明,蛋白點清晰為止。1.2.3麥曲浸提液蛋白圖像的數(shù)據(jù)處理完成染色的雙向電泳凝膠經(jīng)過ImageScannerIII凝膠成像系統(tǒng)掃描并保存圖像,圖像使用PDQuest軟件進(jìn)行對比分析。所有圖像選擇自動找點模式,并手動校正以去除背景噪音和橫縱條紋。對不同時期的麥曲浸提液的雙向電泳圖譜進(jìn)行匹配和比對分析,并對蛋白點的定量值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。定量差異≥2倍認(rèn)定為差異蛋白點。1.2.4質(zhì)量分析的評估和數(shù)據(jù)庫搜索2結(jié)果與討論2.1麥曲中微生物的代謝小麥經(jīng)過碾碎、加水拌曲、壓制成型、堆曲培養(yǎng)和通風(fēng)干燥之后得到成品麥曲。在麥曲的生產(chǎn)過程中,工廠主要是通過控制制曲過程的麥曲品溫來控制麥曲的質(zhì)量。制曲過程中水分、溫度的變化曲線如圖1所示。從圖1中可以看出,小麥經(jīng)過軋碎拌水成型后,進(jìn)入曲房,及時的關(guān)窗措施和稻草覆蓋造成相對封閉的環(huán)境,隨著麥曲水分的逐步揮發(fā)以及麥曲中微生物的生理代謝開始活躍,放出大量的熱,于第4天達(dá)到麥曲中最高品溫(55℃)。在這個高溫下,一些微生物被淘汰,霉菌基本停止生長,開始產(chǎn)生孢子。此后采用開窗等降溫措施,麥曲品溫逐漸回落,在曲塊成型堆放的第1周,麥曲品溫一直維持在37℃以上。此后麥曲品溫逐漸降低,在麥曲制作結(jié)束時,品溫接近室溫。制曲過程中麥曲中的水分一直在減少,從最初的24.0%降至12.4%左右,這時麥曲中微生物已完全停止生長。黃酒麥曲在成型堆放過程中合適的水分和品溫,為麥曲中微生物的生長及代謝產(chǎn)酶提供了條件。根據(jù)制曲過程中麥曲品溫發(fā)生顯著變化時間點的情況,分別選擇固態(tài)發(fā)酵第1、2、3、4、6及30天的麥曲作為制曲過程的6個典型時期樣品,進(jìn)行麥曲浸提液的宏蛋白質(zhì)組學(xué)研究。2.2電泳圖譜蛋白點檢測紹興黃酒麥曲制曲過程中6個不同時期的麥曲浸提液經(jīng)過TCA-丙酮處理后獲得宏蛋白質(zhì)組樣品,每個時期蛋白樣品的上樣量均控制在～550μg左右,使用長度為18cm,pH3～10非線性的IPG膠條進(jìn)行雙向電泳實驗,獲得了分辨率較高的雙向電泳圖譜(見圖2)。應(yīng)用PDQuest軟件對制曲過程中6個不同時期的電泳圖譜進(jìn)行蛋白點檢測,分別檢測到了89、102、110、105、97及100個清晰且重復(fù)度高的蛋白質(zhì)點。對以上6個時期蛋白質(zhì)點的表達(dá)豐度(根據(jù)蛋白質(zhì)點的相對體積自動生成的數(shù)量值)進(jìn)行差異檢測,共找到12個差異蛋白點(見圖3及表1),其中差異蛋白點1-7的局部放大圖見圖4。對制曲過程中差異表達(dá)量變化在2倍以上的12個差異蛋白,按照表達(dá)豐度的變化可分為3類:第1類是隨著制曲過程,蛋白質(zhì)表達(dá)量逐漸上升(蛋白點編號為5、7、9和10);第2類是制曲過程中蛋白表達(dá)量先上升后下降(蛋白點編號為1、2、3、4、6和8);第3類是制曲過程中蛋白表達(dá)量逐漸降低(蛋白點編號為11和12)。2.3-磷酸異構(gòu)酶在成熟期樣品的雙向電泳凝膠上挖取這12個差異蛋白點進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜分析,質(zhì)譜分析所得數(shù)據(jù)通過Mascot在線軟件,對NCBI蛋白質(zhì)總庫進(jìn)行檢索。共有7個蛋白點鑒定成功,鑒定結(jié)果列于表2。由表2可見,鑒定得到的7種蛋白中來自微生物的蛋白有4種,分別是來自地中海擬無枝菌酸菌產(chǎn)生的凝結(jié)因子5/8型功能蛋白和微單孢菌屬產(chǎn)生的蘋果酸脫氫酶,以及糖紅孢紅霉菌產(chǎn)生的葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶和羧肽酶前體蛋白。小麥來源的蛋白有2種,分別是木聚糖酶抑制蛋白I和幾丁質(zhì)酶II。此外還有一種外子藻來源的功能未知的假定蛋白。從鑒定結(jié)果來看,麥曲中存在多種微生物參與各種生物化學(xué)反應(yīng),這也進(jìn)一步證實了制曲過程是多菌種參與發(fā)酵的過程。其中糖紅孢紅霉菌分泌的葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶主要催化糖酵解中葡萄糖-6-磷酸與果糖-6-磷酸的可逆轉(zhuǎn)化。微單孢菌屬分泌的蘋果酸脫氫酶,它催化檸檬酸循環(huán)(三羧酸循環(huán))中蘋果酸與草酰乙酸之間的可逆轉(zhuǎn)換。他們都與丙酮酸、乳酸、蘋果酸、檸檬酸、琥珀酸等黃酒風(fēng)味物質(zhì)的代謝有著一定的關(guān)系。羧肽酶前體蛋白最終生成羧肽酶,羧肽酶是一類肽鏈端水解酶,作用于肽鏈的游離羧基末端釋放單個氨基酸,在黃酒發(fā)酵過程中與酸性蛋白酶共同作用于糯米中的蛋白質(zhì)產(chǎn)生游離的氨基酸,能賦予黃酒特有的風(fēng)味。稀有細(xì)菌地中海擬無枝菌酸菌分泌的凝結(jié)因子5/8型功能蛋白在細(xì)胞表面識別、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起著重要作用。同時麥曲的浸提液中還存在著小麥相關(guān)的蛋白如木聚糖酶抑制蛋白和幾丁質(zhì)酶等。木聚糖酶抑制劑存在于多種谷物中,如小麥、黑麥、大麥、玉米等。谷物中的木聚糖酶抑制劑僅對微生物來源的木聚糖酶有活性,而與植物內(nèi)源性木聚糖酶不發(fā)生作用,因此它們被看作植物防御外來致病性侵害的屏障小麥種子中包含3類木聚糖酶抑制劑:TAXI、XIP、TLXI。在黃酒麥曲中鑒定出的木聚糖酶抑制劑為TAXI。TAXI僅存在于小麥種子中,它對真菌和細(xì)菌木聚糖酶均具有抑制作用,但僅限于G/11家族木聚糖。幾丁質(zhì)酶是一類復(fù)合酶,主要水解幾丁質(zhì)多聚體中的β-1,4-糖苷鍵,產(chǎn)生N-乙酰氨基葡萄糖寡聚體,許多微生物、動物、植物等都可產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶。高等植物的細(xì)胞中本身不含幾丁質(zhì),但當(dāng)植物受到真菌、細(xì)菌或病毒等的感染時,幾丁質(zhì)酶的活性迅速提高。植物產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶大部分為第19族糖基化水解酶類,其功能主要是抑制病原微生物的生長,進(jìn)行自我防御,是重要的病