醫(yī)療器械生物學評價試驗介紹

山東省醫(yī)療器械產(chǎn)品質(zhì)量檢驗中心生物學評價室王昕2021年10月醫(yī)療器械生物學評價相關規(guī)章國家食品藥品監(jiān)督管理總局2021年第43號?關于公布醫(yī)療器械注冊申報資料要求和批準證明文件格式的公告?醫(yī)療器械生物相容性評價研究應對成品中與患者和使用者直接或間接接觸的材料的生物相容性進行評價。生物相容性評價研究資料應當包括：1.生物相容性評價的依據(jù)和方法。2.產(chǎn)品所用材料的描述及與人體接觸的性質(zhì)。3.實施或豁免生物學試驗的理由和論證。4.對于現(xiàn)有數(shù)據(jù)或試驗結果的評價。醫(yī)療器械生物學評價系列標準GB/T16886.1-20局部GB/T16886.1風險管理過程中的評價與試驗5GB/T16886?醫(yī)療器械生物學評價?系列標準

GB/T16886?醫(yī)療器械生物學評價?系列標準GB/T16886.18材料化學表征GB/T16886.19材料物理化學形態(tài)學和外表特性表征GB/T16886.20醫(yī)療器械免疫毒理學試驗原那么和方法8依據(jù)GB/T16886/ISO10993系列標準根本原那么制定了兩項醫(yī)療器械生物學試驗方法的國家標準：GB/T14233.2-2005醫(yī)用輸液、輸血、注射器具檢驗方法第2局部：生物學試驗方法GB/T16175-2021醫(yī)用有機硅材料生物學評價試驗方法1.根本評價試驗細胞毒性---GB/T16886.5刺激或皮內(nèi)反響〔皮膚、皮內(nèi)、眼、口腔、陰道、直腸、陰莖〕---GB/T16886.10致敏---GB/T16886.10血液相容性〔血栓、凝血、血小板、溶血、補體、血液學〕---GB/T16886.4植入試驗〔皮下、肌肉、骨〕---GB/T16886.6全身毒性〔急性全身毒性、重復接觸全身毒性〕---GB/T16886.11遺傳毒性(AEMS、染色體畸變試驗、小鼠淋巴瘤〕---GB/T16886.32.補充評價試驗

〔1〕慢性毒性—口、吸入、經(jīng)皮、靜脈、腹膜、植入途徑。〔2〕致癌性。〔3〕生殖和發(fā)育毒性?！?〕生物降解—聚合物、金屬、合金、陶瓷。醫(yī)療器械生物學試驗樣品制備參考標準：GB/T16886.12-2005〔ISO10993-12:2002)試驗樣品的選擇和制備標準化是保證生物學評價試驗結果可靠性和可比性的很關鍵的一步。在進行試驗以及解釋試驗結果時，應考慮器械在人體應用時的接觸性質(zhì)、程度、頻率、時間和條件等因素，其中最關鍵的因素之一就是試驗樣品的制備。當制備器械浸提液時，所用的浸提介質(zhì)和浸提條件應該既與最終產(chǎn)品的性質(zhì)和用途相適應，又要與試驗方法的可預見性〔如試驗目的、原理、敏感性等〕相適應。因此理想的浸提條件和試驗系統(tǒng)浸提液的應用既要反映產(chǎn)品的實際使用條件，還要反映試驗的目的和預測性。醫(yī)療器械生物學試驗樣品的選擇1.應采用最終產(chǎn)品、最終產(chǎn)品中有代表性的樣品或與最終產(chǎn)品相同的工藝過程制得的材料以及它們的浸提液進行試驗。選擇的樣品必須被證明合理。2.處置試驗樣品與參照樣品時應謹防污染。來自制造過程的任何殘留物應視為器械、器械部件或組件的構成局部。〔1〕試驗樣品如取自非無菌狀態(tài)，但要求使用前滅菌的器械，試驗樣品應按照制造廠家推薦的滅菌方法滅菌，必要時，試驗應采取無菌操作?！?〕如果試驗樣品在滅菌前清洗，應考慮清洗過程和清洗劑對試驗樣品選擇和處置方面的影響。3．如果試驗過程要求無菌試驗樣品，應考慮滅菌或再滅菌過程對試驗樣品和參照材料的影響。4．當試驗樣品和參照材料需要分割成小片時，應考慮原先沒有暴露的外表〔如腔或切面〕的影響。醫(yī)療器械生物學試驗樣品的選擇6.從器械選擇有代表性的局部〔1〕如器械不能以整體用于試驗時，應選取最終產(chǎn)品中各種材料有代表性的局部按比例組合成試驗樣品?！?〕有外表涂層器械的試驗樣品應包括涂層材料和基質(zhì)材料，即使基質(zhì)材料沒有和組織接觸。〔3〕與病人接觸的器械部件在制造過程中如使用了粘結劑、射頻密封或溶劑密封，試驗樣品那么應包括粘接和/或密封處有代表性的局部?！?〕復合材料應作為最終材料進行試驗?！?〕當一個器械由不同的材料組成，在選擇試驗樣品時，應考慮其潛在的協(xié)同作用和相互作用?！?〕選擇的試驗樣品應能使器械組件最大限度地與試驗系統(tǒng)接觸，以了解潛在的生物學。浸提條件和方法浸提溫度浸提時間浸提比例浸提介質(zhì)浸提溫度和浸提時間可采用以下的一個條件進行浸提：(37±1)℃，〔72±2〕h；(50±2)℃，〔72±2〕h；(70±2)℃，〔24±2〕h；(121±2)℃，〔1±0.1〕h；注：在多數(shù)情況下為產(chǎn)品使用適宜的加嚴條件。對于細胞毒性試驗，含血清的細胞培養(yǎng)介質(zhì)可在(37±1)℃，〔24±2〕h條件下浸提。采用高溫浸提時應注意：可能會導致聚合物的交聯(lián)和/或聚合作用增強；可能會引起材料明顯出現(xiàn)降解。可降解材料浸提時要用適當?shù)慕橘|(zhì)、時間、溫度條件來模擬盡可能的過度暴露。完全的溶解是適當?shù)?。標準外表積和浸提液體積注：標準的外表積包括樣品兩面和連接處的面積，不包括不確定外表的不規(guī)那么面積。當由于樣品外形不能確定其外表積時，浸提時可使用質(zhì)量/體積。浸提之前應將材料切成小塊，以使材料浸沒在浸提介質(zhì)中。由于完整外表與切割外表存在潛在的浸提差異，因此對于彈性體、涂層材料、復合材料、層狀薄片等應盡量采用完整的樣品進行試驗。浸提介質(zhì)浸提介質(zhì)例如：極性介質(zhì)：水、生理鹽水、無血清培養(yǎng)皿；非極性介質(zhì)：各國藥典中規(guī)定的新鮮精制植物油〔如棉籽油或芝麻油〕；其余介質(zhì)：乙醇/水、乙醇/生理鹽水、聚乙二醇400〔稀釋至生理滲透壓〕、二甲基亞砜和含血清培養(yǎng)基。浸提液制備的本卷須知浸提應在攪拌的條件下進行。當認為靜態(tài)適宜時，應對試驗方法加以論證、規(guī)定并出具報告。如可能,液體浸提液應在制備后立即使用,以防止吸附在浸提容器上或成分發(fā)生其他變化。不應調(diào)整浸提液的ph值除非給出理由。浸提液一般不應采用過濾、離心或其他方法來去除懸浮的粒子，如果必須進行時，應說明其理由。浸提液制備的本卷須知對于在使用條件下不是可溶解和再吸收的材料和器械，進行浸提的任何溶劑不應導致聚合物發(fā)生分解。聚合材料在揮發(fā)性溶劑中只應發(fā)生輕微變軟〔如小于10%的溶解度〕。如果器械是不能浸提的水狀液體，可用液體直接進行試驗。在正規(guī)使用條件下液體是在器械內(nèi)循環(huán)，可以采用循環(huán)方式進行浸提，盡可能加大一個或多個實驗條件，如溫度、時間、體積、流速。選擇這種浸提方式的根本原理應該在報告中注明。細胞毒性試驗細胞毒性試驗現(xiàn)有版本是GB/T16886.5-2005〔ISO10993-1999〕，GB/T16886.5-20xx〔ISO10993-2021〕正在報批中。敏感性高、重現(xiàn)性好，結果有一定的臨床相關性，因此被廣泛地應用于醫(yī)療器械生物學評價中，特別是作為新材料篩選時的必做試驗。國內(nèi)外無論哪項醫(yī)療器械生物學評價標準中都把細胞毒性試驗列為首位，作為首選工程。概述定義：該試驗采用已建立的細胞系〔ATCCCCL1(NCTCclone929)〕,測定由器械、材料和/或其浸提液造成的細胞溶解(細胞死亡)、以及對細胞生長的抑制和其他影響。意義：該試驗屬體外試驗，能在短期內(nèi)檢出供試品對細胞新陳代謝功能的影響，對毒性物質(zhì)具有較高的敏感性，從而能快速篩選材料。因此，細胞毒性試驗為生物學試驗中首選試驗工程?！惨弧吃u價類型簡介醫(yī)療器械的細胞毒性可以有以下二種評價類型：1.按不同生物學終點評價(1)細胞形態(tài)學評價：定性檢測方法，結果評價相比照較初淺，通常僅作為一種輔助或補充的方法。(2)細胞膜效應評價：中性紅染色法，臺盼蘭染色法，熒光素染色法等。(3)細胞生長能力評價：細胞增殖度測定。(4)細胞代謝特性評價：ＭＴＴ法、各種測定細胞總蛋白量，蛋白質(zhì)合成率和酶活性的方法。2.按不同接觸方式評價

(1)浸提液方式：將供試品浸在介質(zhì)介質(zhì)中，經(jīng)過一定的時間和溫度的作用，取其浸提液與培養(yǎng)的細胞接觸。(2)直接接觸方式：將供試品直接與培養(yǎng)的細胞接觸。(3)間接接觸方式：將細胞與供試品隔開，在該體系中上層的供試品可以通過中間介質(zhì)中的孔隙影響下層的細胞。包括瓊脂擴散試驗、濾膜擴散試驗。常用的細胞毒性試驗MTT〔四唑鹽〕法：哺乳動物細胞的線粒體酶可將黃綠色的MTT降解形成藍紫色的物質(zhì)，用二甲基亞砜〔DMSO〕將其溶解成溶液，用酶標儀測定其濃度，從而定量測定細胞的存活比例。該試驗用于細胞毒性定量評價。對該試驗有干擾的供試品不適于本試驗。浸提方法常用浸提方法舉例：按照4g/20ml浸提介質(zhì)的比例，浸提介質(zhì)為含血清的細胞培養(yǎng)基，〔37±1〕℃，〔24±2〕h。注意：浸提液接觸細胞之前，如果進行過濾、離心等處理，應詳細記錄并對這些步驟加以說明。宜防止對浸提液進行處理，例如對pH值的調(diào)整，因為這會影響到試驗結果。細胞毒性結果分析定性評價：分級到達2級以上時被認為有細胞毒性效應。定量評價：細胞活性下降大于30%被認為有細胞毒性反響。細胞毒性結果評價細胞毒性僅僅是一種最初的信號，它預示存在體內(nèi)毒性的可能性，事實上單憑細胞毒性數(shù)據(jù)還未必能確定該器械一定不適用于特定的臨床應用在對細胞毒性的結果評價時需要結合其他生物相容性數(shù)據(jù)和產(chǎn)品的預期用途進行綜合評價。在解釋試驗數(shù)據(jù)時還必須考慮到該試驗系統(tǒng)的局限性。刺激試驗刺激是不涉及免疫學機制的一次、屢次或持續(xù)與試驗材料接觸所引起的局部炎癥反響。要測定器械、材料及其潛在可溶出物的刺激作用，試驗的進行應與使用或接觸的途徑和持續(xù)時間相適應。刺激試驗具有較高的敏感性，是醫(yī)療器械三項根本生物學評價工程之一。刺激試驗類型皮膚刺激皮內(nèi)反響特殊的刺激試驗：眼、口腔、陰莖、直腸和陰道刺激等注：任何顯示為皮膚刺激物或pH≤2.0或≥11.5的材料也不宜再進行試驗，宜標示為潛在的眼刺激物。任何已顯示為皮膚或眼的刺激物，或pH≤2.0或≥11.5的材料不應再進行試驗，可標示為潛在的口腔、陰莖、直腸、陰道組織組織刺激物。任何顯示為皮膚、眼、黏膜組織刺激物的材料，或是pH≤2.0或≥11.5的材料，不應進行皮內(nèi)試驗。皮內(nèi)反應試驗結果評價

對一些廣泛應用于人體正?；驌p傷皮膚的產(chǎn)品,一般不允許對皮膚有實質(zhì)性危害存在。在某些情況下，陽性試驗劑量不一定就判定材料不能使用。致敏試驗定義：免疫介導的對某種物質(zhì)的皮膚反響。該試驗屬體內(nèi)試驗，方法學相比照較成熟，靈敏性較高，因此為各類醫(yī)療器械必須評價的工程之一。方法最大劑量法封閉斑貼法小鼠局部淋巴結試驗〔LLNA〕試驗結果評價按本標準試驗步驟得出的試驗結果不能單獨成立。陰性試驗結果往往不能排除產(chǎn)品可能導致皮膚過敏反響的可能性。出現(xiàn)陽性試驗結果有時不一定就說明器械或材料不能使用。全身毒性試驗急性全身毒性亞急性全身毒性亞慢性全身毒性慢性毒性熱原反響重復接觸全身毒性試驗

定義急性全身毒性：在24h內(nèi)一次、屢次或持續(xù)接觸試驗樣品后在任何時間發(fā)生的不良作用。注：與藥典上的異常毒性試驗不同。亞急性全身毒性：在24h～28d內(nèi)屢次或持續(xù)接觸試驗樣品后發(fā)生的不良作用。亞慢性全身毒性：反復或持續(xù)接觸試驗樣品后在動物壽命期的某一階段發(fā)生的不良作用。慢性全身毒性：在動物的主要壽命期內(nèi)反復或持續(xù)接觸試驗樣品后發(fā)生的不良作用。重復接觸全身毒性試驗接觸途徑接觸劑量接觸時間接觸途徑GB/T16886.11-2021中規(guī)定，醫(yī)療器械或其可瀝濾物可通過多種接觸途徑進入人體，亞慢性〔亞急性〕全身毒性試驗最好采用具有臨床相關性的接觸途徑，如采用其他接觸途徑應予以論證。接觸方式有皮膚、植入、吸入、皮內(nèi)、肌內(nèi)、腹腔、靜脈、經(jīng)口、皮下等。接觸劑量對于較長期試驗，宜包括至少三種劑量水平和適當?shù)膶φ战M。采用一種適宜的試驗樣品劑量進行單劑量組試驗可判定是否存在毒性危害〔即限度試驗〕，但其他多劑量或劑量反響試驗要求多個劑量組來判定毒性反響。如準備采用加嚴劑量，可增加劑量組。劑量頻率：應具有臨床相關性。在重復接觸試驗中，試驗周期內(nèi)動物最好每周7日接觸試驗樣品。劑量體積：GB/T16886.11-2021中附錄B規(guī)定試驗樣品接觸最大劑量體積，但不應做為常規(guī)接觸劑量的選擇。結果評價觀察工程：體重變化、臨床觀察、臨床病理學、大體病理學、器官稱重、組織病理學等。綜合分析各指標，判定是否具有“生物學相關性〞。應注意此類試驗的局限性，對結果進行科學的判斷。熱原試驗致熱性是某種化學制劑或其他能產(chǎn)生發(fā)熱反響物質(zhì)的一種特性。本局部所涉及的是材料介導的致熱性。常用方法是將材料浸提液由靜脈注入兔內(nèi)，在一定時間內(nèi)觀察兔體溫變化，以判斷在材料或浸提液中所含熱原量是否符合人體應用要求。只做該項試驗尚不能區(qū)分熱原反響是因材料本身還是因內(nèi)毒素污染所致。只有同細菌內(nèi)毒性試驗相結合才能做出熱原反響是否是因材料致熱性所致。內(nèi)毒素介導的致熱性這種致熱形式源自于革蘭氏陰性細菌的生物活性內(nèi)毒素，通常為醫(yī)療器械制造過程中的誘導發(fā)熱的污染物，可采用特異性細菌內(nèi)毒素試驗〔鱟試劑法〕測定器械內(nèi)毒素含量來進行評價。材料介導的致熱性該類型致熱性為非內(nèi)毒素相關因素引起，

一般認為，熱原試驗主要適用于與循環(huán)血液接觸的器械。ASTM規(guī)定，與中樞神經(jīng)系統(tǒng)和胸腔接觸的器械也要進行熱原試驗。注：熱原試驗是靜脈注射，需要考慮浸提液的狀態(tài)。遺傳毒性試驗目的：使用哺乳動物或非哺乳動物細胞培養(yǎng)或其他技術來測定由醫(yī)療器械、材料和(或)其浸提液引起的基因突變、染色體結構和數(shù)量的改變，以及其他DNA或基因毒性。遺傳毒性實驗策略：優(yōu)先體外試驗，方案1：細菌基因突變試驗、哺乳動物細胞基因突變試驗、哺乳動物細胞誘導性試驗.方案2：細菌基因突變試驗、哺乳動物細胞基因突變試驗〔覆蓋誘裂性和基因突變〕。遺傳毒性實驗策略：如果體外試驗出現(xiàn)陽性，應進行體內(nèi)誘變性試驗。常用體內(nèi)試驗包括嚙齒動物微核試驗、嚙齒動物骨髓中期分析、哺乳動物肝細胞程序外DNA合成試驗。血液相容性試驗目的：血液相容性試驗用一個相應的模型或系統(tǒng)評價與血液接觸的醫(yī)療器械或材料對血液或血液成分的作用。血液相容性試驗方法：血栓形成、凝血、血小板、血液學〔溶血、白細胞計數(shù)、白細胞活化、網(wǎng)織紅細胞計數(shù)〕、補體系統(tǒng)血液相容性溶血試驗：供試品的溶血率應小于5%。血

生殖毒性試驗試驗目的：評價試驗樣品對生殖功能、胚胎發(fā)育〔致畸性〕以及胎兒和早期嬰兒發(fā)育潛在影響。生殖毒性試驗可能需要進行生殖及發(fā)育毒性試驗的材料或器械：1.與生殖組織或胚胎〔胎兒〕直接長期或永久接觸的器械。2.儲能醫(yī)療器械。3.可吸收材料或可溶出物質(zhì)?！踩缭谖?、代謝和分布研究方面有充分可靠的數(shù)據(jù)，或者材料或醫(yī)療器械浸提液中鑒別出的所有成分均無生殖和發(fā)育毒性時，就無需進行試驗。重點試驗60內(nèi)容細胞毒性試驗1植入后局部反響試驗2刺激和致敏試驗3細胞毒性的定義根據(jù)歐洲標準化組織CEN1992年30號文件的定義,細胞毒性是指由產(chǎn)品、材料及其浸提物所造成的細胞死亡、細胞溶解和細胞生長抑制。ISO10993.5-2021的定義：Cytotoxicityisanirreversibledamagetolivingcells.對活細胞不可逆的損害。細胞毒性試驗是運用哺乳動物細胞體外培養(yǎng)技術，檢測醫(yī)療器械/材料引起的細胞生長抑制，溶解死亡等毒性作用。體外細胞毒性試驗的特點對毒物高度敏感。試驗周期短，可用于快速篩選。試驗方法標準化，試驗結果重復性好，便于實驗室之間的結果比對。體外細胞毒性試驗具有通用性,廣泛適用于各種醫(yī)療器械和材料的評價。瓊脂擴散濾膜擴散細胞毒性試驗浸提液試驗直接接觸試驗間接接觸試驗定性顯微鏡觀察法MTT

XTT

中性紅攝取集落形成

定量ISO10993.5-2021ISO10993-5:2021和GB/T16886.5-2003(ISO10993-5:1999)的區(qū)別新標準修訂內(nèi)容如下：修改了“材料浸提液的制備〞、“試驗步驟〞“結果評價〞等相關內(nèi)容，給出了細胞毒性定性和定量評價指標；—增加了“附錄A中性紅攝取(NRU)細胞毒性試驗〞；—增加了“附錄B集落形成細胞毒性試驗〞；—增加了“附錄CMTT細胞毒性試驗〞；—增加了“附錄DXTT細胞毒性試驗〞。細胞毒性測定中所使用的大量終點測定方法可分成以下評價類型：

—按形態(tài)學方法評定細胞損傷；

—細胞損傷的測定；

—細胞生長的測定；

—細胞代謝特性的測定。 ISO10993-5:2021術語和定義

近集合subconfluency在對數(shù)生長期末，約80%的細胞融合?？瞻譩lank不含試驗樣品的浸提介質(zhì)，浸提期間置于與試驗樣品相同的器皿中，并經(jīng)受與試驗樣品相同的條件。

浸提液試驗浸提液試驗結果的重現(xiàn)性穩(wěn)定。樣品與其他類似器械或材料的結果在實驗室內(nèi)部和各實驗室間的水平上具有可比性。浸提液試驗被普遍認可。a)含血清培養(yǎng)基;b)生理鹽水溶液;c)其他適宜的介質(zhì)。含血清培養(yǎng)基是首選的浸提介質(zhì)，優(yōu)先選用含血清培養(yǎng)基用于浸提是由于其具有支持細胞生長以及浸提極性和非極性兩種物質(zhì)的能力。除了含血清培養(yǎng)基，在明確要浸提極性物質(zhì)〔例如離子化合物〕時宜考慮采用無血清培養(yǎng)基。其他適宜的介質(zhì)包括水和二甲基亞砜〔DMSO〕。在所選擇的測試系統(tǒng)中,DMSO如高于0.5％〔體積分數(shù)〕時有細胞毒性。與含血清培養(yǎng)基浸提法相比，由于DMSO浸提液稀釋度較大，溶出物的細胞接觸濃度會比較低。

浸提介質(zhì)

含血清培養(yǎng)基按照a)〔37±1〕℃規(guī)定的浸提條件，因為浸提溫度超過〔37±1〕℃會對血清化學和/或血清穩(wěn)定性以及培養(yǎng)基中其他成分產(chǎn)生不良影響。浸提液接觸細胞之前，如果進行過濾、離心或用其他方法處置，最終報告中對此應詳細記錄并對這些步驟加以說明，對浸提液pH值的調(diào)整也應在報告中說明。宜防止對浸提液進行處理，例如對pH值的調(diào)整，因為這會影響到試驗結果。浸提條件

細胞系優(yōu)先采用已建立的細胞系并應從認可的貯源獲取。假設貯存某一原種培養(yǎng)細胞系時,那么應將其放在相應培養(yǎng)基內(nèi),在－80℃或－80℃以下凍存，培養(yǎng)基內(nèi)加有低溫防護劑,如二甲基亞砜或甘油。長期貯存〔數(shù)月至數(shù)年〕只能在－130℃或－130℃以下凍存。培養(yǎng)基培養(yǎng)基應無菌。含血清或無血清培養(yǎng)基應符合選定細胞系的生長要求。培養(yǎng)基中可含有對試驗無不良作用的抗生素。

原種培養(yǎng)細胞制備用選定的細胞系和培養(yǎng)基制備試驗所需的細胞。使用存儲細胞時,如加有低溫防護劑要除去,使用前至少傳代培養(yǎng)一次。傳代培養(yǎng)細胞時,采用適合細胞系的酶分散法和/或機械分散法。

試驗步驟平行樣數(shù)應至少采用三個平行試驗樣品數(shù)和對照品數(shù)。浸提液試驗本試驗用于細胞毒性定性和定量評定。試驗宜在近集合單層細胞或新鮮懸浮細胞上進行。試驗開始前用顯微鏡驗證培養(yǎng)細胞的近集合和形態(tài)學情況。經(jīng)過至少24h的培養(yǎng)后，確定細胞毒性反響。

細胞毒性的測定可采用定性或定量方法測定細胞毒性反響。定性評價:用顯微鏡檢查細胞，必要時采用細胞化學染色，評價諸如一般形態(tài)、空泡形成、脫落、細胞溶解和胞膜完整性等方面的改變。在試驗報告中應描述性地或以數(shù)字記錄正常形態(tài)的變化，表1給出了用于對試驗樣品分級的方法。表1浸提液細胞毒性形態(tài)學定性分級級別反應程度全部培養(yǎng)細胞觀察0無胞漿內(nèi)有離散顆粒，無細胞溶解，無細胞增殖下降情況1極輕微不超過20%的細胞呈圓縮、疏松貼壁、無胞漿內(nèi)顆?；蝻@示形態(tài)學方面的改變；偶見細胞溶解；僅觀察到極輕微的細胞生長抑制現(xiàn)象。2輕度不超過50%的細胞呈圓縮、無胞漿內(nèi)顆粒，無大范圍細胞溶解；可觀察到不超過50%的細胞生長抑制現(xiàn)象。3中度不超過70%的細胞層包含圓縮細胞或溶解細胞；細胞層未完全破壞，但可觀察到超過50%的細胞生長抑制現(xiàn)象4重度細胞層幾乎完全或完全破壞正常開始正常中間正常結束正常細胞給毒后的細胞形態(tài)：陰性對照空白對照陽性對照四級結果浸提液試驗的定量評價定量評價:測定細胞死亡、細胞生長抑制、細胞增殖或克隆形成?？梢杂每陀^的方法對細胞數(shù)量、蛋白總量、酶的釋放、活體染料的釋放、活體染料的復原或其他可測定的參數(shù)進行定量測試。試驗報告中應記錄使用的方法和反響。ISO10993-5：2021規(guī)定細胞活性下降大于30%被認為有細胞毒性反響。

ISO10993-5：2021附錄C〔資料性附錄〕MTT細胞毒性試驗原理通過細胞代謝活性測定細胞的存活率。MTT黃色水溶液

(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid)在活細胞內(nèi)代謝性減少，生成藍紫色不可溶的甲瓚。甲瓚溶于異丙醇后用分光光度計測定的色度與活細胞數(shù)目相關。試驗步驟根本步驟L929細胞接種至96孔板，維持培養(yǎng)24h〔～1倍周期〕，至形成半集合單層。然后與系列濃度試驗化合物接觸。接觸24h后測定每一試驗濃度甲瓚形成，與對照培養(yǎng)細胞的甲瓚形成進行比較。計算每一試驗濃度生長抑制百分比。材料試驗用細胞系采用L929細胞(NCTCclone929:CCL1,AmericanTypeCultureCollection[ATCC],Manassas,VA,USA;ECACCNo.88102702,EuropeanCollectionofCellCultures,Salisbury,WiltshireSP40JG,UK)，試驗用細胞應無支原體感染。試驗質(zhì)量檢查〔Ⅰ〕:陽性對照(PC)和陰性對照(NC)試驗質(zhì)量檢查〔Ⅱ〕：空白未經(jīng)處理空白的光密度〔OD570〕絕對值可說明，在試驗的兩天內(nèi)以每孔1×104接種的細胞是否以正常的倍增時間以指數(shù)方式增長?？瞻譕D570平均值如≥0.2，那么試驗符合接受標準。為了檢查細胞接種系統(tǒng)誤差，將空白加到96孔板的左〔第2列〕、右〔第11列〕兩側。左、右兩列空白平均值與全部空白平均值相差如不大于15%，那么試驗符合接受標準。對于細胞接種誤差的檢查，也可以通過相差顯微鏡檢查每塊板，以確保細胞數(shù)量一致。采用顯微鏡評價那么可免除兩列空白的操作。

MTT細胞毒性試驗操作流程時間

h步驟00:00接種96孔板：1×104個細胞/100μLMEM培養(yǎng)基/孔孵育（37℃/5%CO2/22h至26h）↓24:00除去培養(yǎng)基↓24:00加入用試驗用培養(yǎng)基制備的≥4個濃度的試驗樣品浸提液（100μL）(未處理空白=試驗用培養(yǎng)基)孵育（37℃/5%CO2/24h）↓48:00形態(tài)學改變的顯微鏡評價除去培養(yǎng)基加入50μLMTT溶液孵育（37℃/5%CO2/2h）↓51:00除去MTT溶液每孔加入100μL異丙醇震蕩滴定板↓51:30在570nm測量吸光度（參照650nm）數(shù)據(jù)記錄試驗樣品〔100%浸提液〕組試驗細胞存活率下降至如<空白組試驗細胞存活率的70%，那么具有潛在的細胞毒性。ISO10993-5：2021附錄D〔資料性附錄〕XTT細胞毒性試驗原理通過線粒體脫氫酶的測定反響細胞的存活率。XTT(2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino)carbonyl]-2H-tetrazoliumhydroxide)與線粒體脫氫酶反響，生成水溶性甲瓚。用分光光度計測定的色度與活細胞數(shù)目相關。細胞系采用L929細胞(NCTCclone929:CCL1,AmericanTypeCultureCollection[ATCC],Manassas,VA,USA;ECACCNo.88102702,EuropeanCollectionofCellCultures,Salisbury,WiltshireSP40JG,UK)，細胞培養(yǎng)物應無支原體。試驗質(zhì)量檢查〔Ⅰ〕:陽性對照(PC)和陰性對照(NC)每項細胞毒性試驗都包括陽性對照和陰性對照。試驗質(zhì)量檢查〔Ⅱ〕：空白未經(jīng)處理空白的光密度〔OD450〕絕對值可說明，在試驗的兩天內(nèi)以每孔1×104接種的細胞是否以正常的倍增時間以指數(shù)方式增長。空白OD450平均值如≥0.2，那么試驗符合接受標準。為了檢查細胞接種系統(tǒng)誤差，將空白加到96孔板的左〔第2列〕、右〔第11列〕兩側.左、右兩列空白平均值與全部空白平均值相差如不大于15%，那么試驗符合接受標準。對于細胞接種誤差的檢查，也可以通過相差顯微鏡檢查每塊板，以確保細胞數(shù)量一致。采用顯微鏡評價那么可免除兩列空白的操作。

XTT細胞毒性試驗操作流程時間h步驟00:00接種96孔板：1×104個細胞/100μLMEM培養(yǎng)基/孔孵育（37℃/5%CO2/22h至26h）↓24:00除去培養(yǎng)基↓24:00加入用試驗用培養(yǎng)基制備的≥4個濃度的試驗樣品浸提液（100μL）(未處理空白=試驗用培養(yǎng)基)孵育（37℃/5%CO2/24h）↓48:00形態(tài)學改變的顯微鏡評價加入50μLXTT/PMS溶液孵育（37℃/5%CO2/3h～5h）↓51:00震蕩平板每孔中吸出100μL加到新平板中↓51:30在450nm測量吸光度（參照630nm）數(shù)據(jù)分析活細胞數(shù)減少是由于樣品中線粒體脫氫酶總活性降低，這直接與生成的橙色甲瓚量有關，在450nm測量光密度。與空白比較計算存活率下降情況。數(shù)據(jù)記錄試驗樣品〔100%浸提液〕組試驗細胞存活率下降至如<空白組試驗細胞存活率的70%，那么具有潛在的細胞毒性。ISO10993.5-2021附錄A〔資料性附錄〕

中性紅攝取(NRU)細胞毒性試驗概述將BALB/c3T3細胞接種至96孔平板內(nèi)并維持培養(yǎng)24h〔～1倍周期〕，至形成半集合單層。然后與系列濃度的試驗混合物接觸，24h后測定每一試驗濃度的NRU并與對照培養(yǎng)細胞測定進行比較。BALB/c3T3細胞、clone31〔如ECACC86110401，EuropeanCollectionofCellCultures,Salisbury,WiltshireSP40JG,UK；CCL-163，AmericanTypeCultureCollection[ATCC],Manassas,VA,USA)和從CCL-163[ATCC]制備的JCRB9005〔HumanScienceResearchResourcesBank,Osaka,Japan〕。細胞系試驗質(zhì)量檢查〔Ⅰ〕:陽性對照(PC)細胞毒性試驗應包括陽性對照。多數(shù)化學物有歷史資料或?qū)嶒炇覂?nèi)、實驗室間重復試驗的支持，十二烷基硫酸鈉〔SLS,CAS#151-21-3〕即是最經(jīng)常用于試驗的一種化學物，因此推薦作為陽性對照。在使用SLS時推薦四個濃度標度：0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.15mg/mL、0.2mg/mL。SLS的IC50歷史平均值(Spielmannet.al.,1991[10])為0.093mg/mL。95%置信區(qū)間為0.070mg/mL至0.116mg/mLSLS的IC50如在95%置信區(qū)間，那么試驗符合標準。推薦使用陽性參照材料和陰性參照材料試驗質(zhì)量檢查〔Ⅱ〕：空白未經(jīng)處理空白的光密度〔OD540〕絕對值可說明，在試驗的兩天內(nèi)以每孔1×104接種的細胞是否以正常的倍增時間以指數(shù)方式增長?？瞻譕D540平均值如≥0.3，那么試驗符合接受標準。為了檢查細胞接種系統(tǒng)誤差，將空白加到96孔板的左〔第2列〕、右〔第11列〕兩側。左、右兩列空白平均值與全部空白平均值相差如不大于15%，那么試驗符合接受標準。對于細胞接種誤差的檢查，也可以通過相差顯微鏡檢查每塊板，以確保細胞數(shù)量一致。采用顯微鏡評價那么可免除兩列空白的操作。試驗質(zhì)量檢查〔Ⅲ〕：濃度-反響質(zhì)量檢查由濃度-反響得出的IC50宜至少有兩個或三個〔NRU抑制率在10%和90%之間的反響作為支撐。否那么，濃度稀釋因子可能易于降低，放棄該試驗并采用較小的稀釋因子重復試驗。

3T3NRU細胞毒性試驗操作流程時間

h步驟00:00接種96孔板：1×104個細胞/100μLDMEM培養(yǎng)基/孔孵育（37℃/5%CO2/22h至26h）↓24:00除去培養(yǎng)基↓24:00加入用試驗用培養(yǎng)基制備的8個濃度的試驗樣品浸提液（100μL）(未處理空白=試驗用培養(yǎng)基)孵育（37℃/5%CO2/24h）↓48:00形態(tài)學改變的顯微鏡評價除去試驗用培養(yǎng)基用150μLPBS沖洗一次加入100μLNR培養(yǎng)基孵育（37℃/5%CO2/3h）51:00傾倒出NR培養(yǎng)基用150μLPBS沖洗一次加入150μLNR洗脫液定色（乙醇/乙酸液）↓

51:40震蕩滴定板10min

51:50在540nm測量NR吸光度（即細胞活性）

樣品浸提液最高濃度〔100%浸提液〕的細胞相對活性如≥對照組的70%，材料應被認為無細胞毒性。浸提液如顯示細胞毒性反響，計算每一試驗濃度〔即試驗化學物濃度〕的生長抑制率。從濃度反響計算IC50〔即產(chǎn)生50%NRU復原的濃度〕，以浸提液稀釋百分比表示。浸提原液為100%浸提液。

數(shù)據(jù)分析ISO10993-5：2021附錄B〔資料性附錄〕

集落形成細胞毒性試驗試驗概述將V79細胞加到6孔板中，保持培養(yǎng)24h至開始對數(shù)生長階段。然后與系列濃度的試驗物接觸，孵育6天，于集落較大時計數(shù)。用甲醇固定集落，吉姆薩液染色并計數(shù)。細胞系V79細胞〔JCRB0603,HumanScienceResearchResourcesBank,Osaka,Japan；或美國和歐洲細胞庫的其他細胞〕注：推薦使用V79細胞，因為其能形成大并清晰的集落。試驗質(zhì)量檢查〔Ⅰ〕:陽性對照(PC)陰性材料(NC)細胞毒性試驗應包括陽性對照和陰性對照。如ZDEC和ZDBC。ZDEC的IC50宜不超過7%。ZDBC的IC50宜不超過80%。試驗質(zhì)量檢查〔Ⅱ〕：空白空白集落平均數(shù)如至少為細胞板每孔細胞數(shù)目的70%，那么試驗符合接受標準。試驗質(zhì)量檢查〔Ⅲ〕：濃度-反響質(zhì)量檢查由濃度-反響得出的IC50宜至少有兩個或三個對照抑制率在10%和90%之間的反響作為支撐。否那么，濃度稀釋因子可能易于降低，放棄該試驗并采用較小的稀釋因子重復試驗。試驗步驟注意：原種細胞解凍后，細胞在用于試驗之前要傳代2～3次。第1天用MEM05培養(yǎng)基制備33.3個細胞/mL的細胞懸液。6孔板的每孔參加3mL細胞懸液。第2天孵育24h后從每孔中吸出培養(yǎng)基。參加2mL用MEM05培養(yǎng)基制備的100%浸提液或稀釋浸提液。每一濃度平行制備3孔。置培養(yǎng)箱再孵育6天。第8天從每孔中吸出培養(yǎng)基，用PBS沖洗每一孔，參加甲醇固定集落，再用5%吉姆薩液染色。計算每一孔集落數(shù)目。結果表示集落形成細胞毒性試驗平板效率如≥對照組的70%，材料應被認為無細胞毒性。浸提液如對細胞顯示細胞毒性作用，計算IC50(濃度抑制率至50%)，以浸提液百分比表示。注：平板效率：對照組集落數(shù)目除以浸提液組集落數(shù)目，以百分數(shù)表示系數(shù)。直接接觸試驗本試驗用于細胞毒性定性和定量評價。在每只器皿中央部位的細胞層上各小心地放置一個試驗樣品的試樣,確保試樣覆蓋細胞層外表約十分之一。適當?shù)呐囵B(yǎng)周期〔最少24h〕。按表2確定細胞毒性反響。間接接觸試驗-瓊脂擴散試驗本試驗用于細胞毒性定性評價。不適用于不能通過瓊脂層擴散或可能與瓊脂相互作用的可瀝濾物。將試驗樣品的試樣小心地放在每只器皿的固化瓊脂層上,確保試樣覆蓋細胞層外表約十分之一。適當?shù)呐囵B(yǎng)周期〔培養(yǎng)24h～72h〕。按表2確定細胞毒性反響。間接接觸試驗-濾膜擴散試驗本試驗用于細胞毒性定性評價?？讖?.45μm、無外表活性劑的濾膜。將試驗樣品的試樣小心地放到濾膜無細胞面的上面。濾膜上放置不產(chǎn)生反響的環(huán),用以保存浸提液和新參加的混合物。適當?shù)呐囵B(yǎng)周期〔培養(yǎng)2h±10min〕。按表2確定細胞毒性反響。表2瓊脂和濾膜擴散試驗及直接接觸試驗反響分級級別反應程度反應區(qū)域觀察

0無試樣周圍和試樣下面未觀察到反應區(qū)域

1極輕微試樣下面有一些畸形細胞或退化細胞2輕度反應區(qū)域局限在試樣下方范圍3中度反應區(qū)域超出試樣尺寸1.0cm

4重度反應區(qū)域超出試樣1.0cm以上植入后局部反響試驗ISO10993-6:2007和GB/T16886.6-1997〔ISO10993-6:1994〕的區(qū)別：新標準修訂內(nèi)容如下：修改了“范圍〞，適用范圍增加可降解和/或可吸收性材料；修改了“植入試驗方法通那么〞、“評價和試驗報告〞、“肌肉植入中植入樣品的數(shù)量〞等相關內(nèi)容；增加了“試驗方法的根本方面〞；增加了“附錄A可降解/可吸收性材料植入周期和組織反響的根本考慮〞；增加了“附錄E植入后局部生物學反響評價舉例〞。概述植入后局部反響試驗是把醫(yī)療器械材料植入實驗動物肌肉，皮下組織，骨組織中，在一定周期后，通過肉眼觀察和顯微技術評價植入部位和周圍組織反響情況，樣品對活體組織的局部毒性作用?？赡苄枰M行植入試驗的樣品〔一〕組織反響的根本過程1炎癥期：以炎癥細胞滲出和浸潤為主，〔1〕早期主要以中性粒細胞和淋巴細胞為主；〔2〕后期出現(xiàn)以淋巴細胞、單核細胞〔巨噬細胞〕、漿細胞為主的反響--細胞成分可因材料的不同而不同。一般2-4周炎癥反響最強，以后逐漸減弱，3個月后炎癥反響應根本消失。例如：纖維蛋白膠：漿細胞和嗜酸粒細胞；膠原蛋白材料：淋巴細胞和異物細胞；

2纖維組織化期：在炎癥期的炎癥反響外側出現(xiàn)纖維母細胞為主的肉芽組織，隨著炎癥反響的消退，以及纖維細胞增生和分泌膠原纖維，纖維細胞逐漸減少，最終被纖維組織形成的包囊包裹。〔二〕植入部位試驗樣品應植入與材料臨床應用最相關的組織：1〕肌肉植入2〕皮下植入3〕骨植入4〕特殊部位植入植入方式肌肉植入皮下組織植入骨植入

肌肉植入皮下植入骨植入肌肉植入試驗把一定大小形狀的試驗樣品植入實驗動物的肌肉組織，同樣植入標準對照材料，對照材料是已確立臨床可接收性和生物相容性良好的同類樣品材料。定期采集標本和周圍組織，肉眼和顯微鏡下比較觀察試驗樣品和對照材料引起的組織生物學反響。皮下組織植入試驗用于評定皮下組織對植入材料的生物學反響。對試驗樣品植入物與對照樣品植入物的生物學反響進行比較，對照材料是已確立臨床可接受性和生物相容性的醫(yī)療器械所采用的材料。骨植入試驗把植入物插入實驗動物的骨組織內(nèi)，對試驗樣品植入物與對照樣品植入物的生物學反響進行比較，對照材料是已確立臨床可接收性和生物相容性良好的同類樣品材料。實驗動物實驗用兔被普遍選用。對于短期試驗，通常使用嚙齒動物或家兔。對于長期試驗，嚙齒動物、家兔、犬、綿羊、山羊、豬及其他平均壽命相對較長的動物比較適宜?！踩硺悠分苽鋺鶕?jù)最終產(chǎn)品預期所用方法對每個植入樣品進行制造、處理、污染物的清洗和滅菌，并應在研究文件中進行確認。皮下植入樣品制備樣品狀態(tài)a)薄片材料應制成直徑10mm～12mm、厚度0.3mm～1.0mm的試驗樣品。b)塊狀材料應制成直徑1.5mm、長5mm、兩端為圓頭的試驗樣品。c)非固體試驗樣品〔包括粉劑〕應裝入直徑1.5mm、長5mm的導管內(nèi)。樣品數(shù)量：每種材料和每一植入期至少采用3只動物和足夠的植入部位，總數(shù)到達10個試驗樣品和10個對照樣品。肌肉植入樣品制備樣品狀態(tài)：寬1mm～3mm、長度約10mm較大樣品：直徑10mm、厚度3mm樣品應制成圓形邊緣，兩端拋光至純圓半徑。樣品數(shù)量：每一植入期至少采用3只動物和足夠的植入部位，總數(shù)到達10個試驗樣品和10個對照樣品。骨植入樣品制備樣品狀態(tài)：家兔：直徑2mm、長6mm的圓柱體樣品數(shù)量：每一植入期應評價至少10個試驗樣品和10個對照樣品。〔四〕試驗周期試驗周期應根據(jù)臨床可能接觸時間來確定，或是持續(xù)至相應生物學反響到達或超過某一穩(wěn)定狀態(tài)。選擇的時間點應進行說明和論證。非降解、非吸收性材料：1〕短期反響：1周到4周；2〕長期反響：12周以上。結論結論：在本試驗以下情況下，試驗樣品判定為：—無刺激〔0.0～2.9〕—輕微刺激〔3.0～8.9〕—中度刺激〔9.0～15.0〕—重度刺激〔>15〕與陰性對照樣品比較組織反響。生物降解試驗參考標準：GB/T16886.6試驗周期應與植入部位、植入物的尺寸、估計的降解時間相關。可降解/可吸收性材料植入周期和組織反響的根本考慮應對植入物各時間點與降解過程相關的局部組織反響進行評價〔不推薦單一的植入時間點〕：a)發(fā)生降解時；b)中期降解階段；c)到達穩(wěn)定狀態(tài)時，組織恢復或接近完全降解〔一般需要到達或超過吸收終點，即完成預期的重塑和修復的最終組織反響或生物反響恢復至正常組織學〕。刺激與皮膚致敏試驗

ISO10993-10:2021和GB/T16886.10-2005(ISO10993-10:2002)的區(qū)別新標準修訂內(nèi)容如下：修改了標準名稱；修改了術語和定義；取消了原“5.4材料鑒別〞；皮內(nèi)反響試驗由附錄B調(diào)整到正文中；人體皮膚刺激試驗方法由正文調(diào)整到附錄C；皮膚致敏試驗增加小鼠局部淋巴結檢驗法；增加了附錄D體外皮膚刺激試驗；增加了附錄E聚合物試驗材料浸提液制備方法。皮膚致敏試驗

概念皮膚致敏skinsensitization變應性接觸性皮炎。免疫介導的對某種物質(zhì)的皮膚反響。是一種免疫應答反響。目前三種測定化學物潛在皮膚致敏性的動物試驗最大劑量致敏試驗(GPMT)封閉式貼敷試驗(Buehler試驗)小鼠局部淋巴結試驗〔LLNA〕皮膚致敏試驗GPMTBTLLNA皮膚評分致敏性評價BrDU淋巴細胞分析皮膚致敏試驗豚鼠最大劑量試驗(GPMT)：最敏感的方法封閉式貼敷試驗(Buehler試驗)：適用于局部應用產(chǎn)品。小鼠局部淋巴結試驗〔LLNA〕：豚鼠試驗的唯一替代試驗，用于檢驗單一化學物，并且目前為化學物的首選測定法。注：全部三種方法被開發(fā)用于測定化學物的致敏潛能，即接觸性皮炎、遲發(fā)型〔Ⅳ型〕超敏反響最大劑量致敏試驗(GPMT)經(jīng)皮內(nèi)注射誘導，斑貼激發(fā)的方式將試驗材料或其浸提液作用于豚鼠，在規(guī)定時間內(nèi)觀察豚鼠激發(fā)部位皮膚反響，以評價樣品是否具有引起遲發(fā)性超敏反響的潛能。最大劑量致敏試驗適用范圍適用于評價與人體接觸所有類型的產(chǎn)品及其浸提液。最大劑量致敏試驗過程皮內(nèi)誘導階段〔試驗樣品皮下注射〕→7天后局部誘導階段〔試驗樣品敷貼48小時〕→14天后激發(fā)階段〔試驗樣品敷貼24小時〕→結果觀察24小時和48小時。Magnusson和Kligman分級敷貼試驗反應等級無明顯改變0散發(fā)性或斑點狀紅斑1中度融合性紅斑2重度紅斑和/或水腫3GPMT陽性試驗〔0.1%DNCB〕

結果評價按Magnusson和Kligman分級標準，對照組動物分級小于1，而試驗組中分級大于或等于1時一般提示致敏。如對照組動物分級大于或等于1時，試驗組動物反響超過對照組中最嚴重的反響那么認為致敏。小鼠局部淋巴結試驗〔LLNA〕在小鼠耳背部局部處置某一試驗樣品后，測定鼠耳應用部位引流淋巴結內(nèi)淋巴細胞的增殖程度。指定某種試驗材料為致敏物，其臨界值是與對照活性比較細胞增殖應答為3倍或更多。封閉貼敷試驗(Buehler試驗)采用封閉斑貼誘導，激發(fā)方式將試驗材料或其浸提液作用于豚鼠，在規(guī)定時間內(nèi)觀察豚鼠激發(fā)部位皮膚反響，以評價樣品是否具有引起遲發(fā)性超敏反響的潛能。封閉貼敷致敏試驗適用范圍適用于預測中度至重度致敏物，不能采用最大劑量致敏試驗法的樣品或接觸表皮的樣品。封閉貼敷致敏試驗過程誘導階段〔一周敷貼3次，每次6小時。連續(xù)3周〕→→14天后激發(fā)階段〔試驗樣品換位敷貼6小時〕→結果觀察24小時和48小時。

結果評價同最大劑量致敏試驗

刺試激驗定義刺激(irritation)：一次、屢次或持續(xù)與一種物質(zhì)〔材料〕接觸所引起的局部非特異性炎癥反響。注：皮膚刺激是一種可逆反響，主要以皮膚紅斑〔發(fā)紅〕為特征。非免疫應答反響。分類皮膚刺激皮內(nèi)反響粘膜刺激陰道刺激直腸刺激陰莖刺激口腔粘膜刺激眼刺激首選試驗動物為家兔口腔粘膜刺激試驗動物為金黃地鼠動物選擇動物皮膚刺激試驗采用相關動物模型對材料在試驗條件下產(chǎn)生皮膚刺激反響的潛能做出評定。模擬樣品臨床使用，將樣品或樣品浸提液直接貼敷于動物皮膚上，在規(guī)定的時間內(nèi)觀察動物皮膚反響，以評價樣品是否具有潛在的皮膚刺激作用。動物皮膚刺激試驗適用范圍適用于預期與人體正?；驌p傷皮膚接觸的醫(yī)療器械和材料動物皮膚刺激試驗試驗動物健康、初成年的白化兔，雌雄不限，同一品系，體重不低于2kg。使用數(shù)量3只如預期有刺激反響，初試應考慮使用1只動物。除非出現(xiàn)明顯的陽性反響紅斑或水腫記分大于2，否那么應至少再使用2只動物進行試驗。

試驗步驟動物準備試驗前4h～24h將動物背部脊柱兩側被毛除去(約10cm×15cm區(qū)域)。試驗樣品的應用粉劑或液體樣品將0.5g或0.5mL的試驗材料直接置于皮膚。固體和疏水性材料無需濕化處理，粉劑使用前宜用水或其他適宜的溶劑稍加濕化。用2.5cm×2.5cm非封閉式的敷料(如吸收性紗布塊)覆蓋接觸部位，然后用繃帶〔半封閉性或封閉性〕固定敷貼片至少4h。接觸期結束后取下敷貼片，用持久性墨水對接觸部位進行標記。樣品浸提液將相應的浸提液滴到2.5cm×2.5cm大小的吸收性紗布塊上，浸提液的用量以能浸透紗布塊為宜，一般每塊紗布滴0.5mL，按圖1所示部位敷貼于動物背部兩側。用繃帶〔半封閉性或封閉性〕覆蓋敷貼部位至少4h。接觸期結束后取下敷貼片，用持久性墨水對接觸部位進行標記，并用適當?shù)姆椒ǔ埩粼囼灢牧?。動物皮膚刺激試驗部位結果評價單次接觸試驗按以下規(guī)定確定原發(fā)性刺激指數(shù)(PII)。觀察時間(24±2)h、(48±2)h和(72±2)h將每只動物全部原發(fā)性刺激記分相加后再除以動物總數(shù)〔一般為3〕得出試驗樣品原發(fā)性刺激指數(shù)。當采用空白或陰性對照時，計算出對照原發(fā)性刺激記分，將試驗材料原發(fā)性刺激記分減去該記分，即得出原發(fā)性刺激記分。皮膚刺激記分系統(tǒng)反應刺激計分紅斑和焦痂形成

無紅斑0極輕微紅斑(勉強可見)1清晰紅斑2中度紅斑3重度紅斑(紫紅色)至無法進行紅斑分級的焦痂形成4皮膚刺激記分系統(tǒng)〔續(xù)〕水腫形成

無水腫0極輕微水腫(勉強可見)1