SDS蛋白電泳標(biāo)準(zhǔn)操作(純度檢測(cè))目的：檢測(cè)蛋白質(zhì)的純度是否達(dá)到生產(chǎn)抗體的要求。依據(jù)：《分子克隆手冊(cè)》，Ab-mart公司內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)。三.職責(zé)：質(zhì)量控制部。試劑與水：所有試劑為分析純（AR）；水為蒸餾水或超純水。五.器皿與耗品：所有玻璃器皿使用前用玻璃清潔劑清洗,80℃烤干。tube、tip一次性使用。六.儀器設(shè)備：電泳儀（電源1--300V）電泳槽灌膠模具染色具凝膠掃描儀七.環(huán)境要求：相對(duì)潔凈環(huán)境，室溫。八.溶液的配置：A液：1.5MTris·HClpH8.8稱取18.15gTris堿(分析純)加適量的超純水溶解,用濃鹽酸(分析純)調(diào)pH值至8.8,加超純水定容至100ml。貼上標(biāo)貼，4℃保存。此溶液有效使用期限為三個(gè)月。（溶液配置臺(tái)帳見(jiàn)附件）B液:1MTris·HClpH6.8稱取12.1gTris堿(分析純)加適量的超純水溶解,用濃鹽酸(分析純)調(diào)pH值至6.8,加超純水定容至100ml。貼上標(biāo)貼，4℃保存。此溶液有效使用期限為三個(gè)月。（溶液配置臺(tái)帳見(jiàn)附件）C液:30%丙烯酰胺稱取29.2g丙烯酰胺(分析純),0.8gN,N’-甲叉雙丙烯酰胺(分析純),加適量的超純水溶解,再定容至100ml,用濾紙過(guò)濾,。貼上標(biāo)貼，避光4℃保存。此溶液有效使用期限為三個(gè)月。（溶液配置臺(tái)帳見(jiàn)附件）D液:10%SDS稱取10gSDS(分析純),用超純水溶解至100ml.貼上標(biāo)貼，室溫儲(chǔ)存。此溶液有效使用期限為三個(gè)月。（溶液配置臺(tái)帳見(jiàn)附件）E液:10%過(guò)硫酸胺稱取10g過(guò)硫酸胺(分析純),用超純水溶解至100ml。貼上標(biāo)貼，-20℃保存。此溶液有效使用期限為三個(gè)月。（溶液配置臺(tái)帳見(jiàn)附件）F液:TEMED(amersco)電泳緩沖液(10X)稱取60.57gTris堿(分析純),288.268g甘氨酸(分析純),20gSDS(分析純),加超純水定容至2000ml，臨用前加超純水稀釋10倍，貼上標(biāo)貼，室溫儲(chǔ)存。此溶液有效使用期限為三個(gè)月。（溶液配置臺(tái)帳見(jiàn)附件）2X樣品緩沖液（還原性）稱取4gSDS(分析純)，0.2g溴酚藍(lán)(分析純)，加20ml甘油(分析純)，10ml1MTris·HClpH6.8，10mlβ-巰基乙醇(分析純)，加超純水溶解至100ml，貼上標(biāo)貼，室溫儲(chǔ)存。此溶液有效使用期限為三個(gè)月。（溶液配置臺(tái)帳見(jiàn)附件）考馬氏亮藍(lán)染色液稱取1g考馬氏亮藍(lán)R－250(分析純)，200ml甲醇(分析純)，50ml冰醋酸(分析純)，加超純水至溶解至500ml,貼上標(biāo)貼，室溫儲(chǔ)存。此溶液有效使用期限為三個(gè)月。（溶液配置臺(tái)帳見(jiàn)附件）考馬氏亮藍(lán)脫色液量取2250ml乙醇(分析純)，500ml冰醋酸(分析純)，加超純水溶解至5000ml,貼上標(biāo)貼，室溫儲(chǔ)存。此溶液有效使用期限為三個(gè)月。（溶液配置臺(tái)帳見(jiàn)附件）6X樣品緩沖液（還原性）稱取12gSDS(分析純)，0.6g溴酚藍(lán)(分析純)，加40ml甘油(分析純)，10ml3MTris·HClpH6.8，30mlβ-巰基乙醇(分析純)，加超純水溶解至100ml，貼上標(biāo)貼，室溫儲(chǔ)存。此溶液有效使用期限為三個(gè)月。（溶液配置臺(tái)帳見(jiàn)附件）(-20C儲(chǔ)存,有效期可能會(huì)更長(zhǎng))銀染試劑固定液：量取250ml甲醇(分析純)，60ml冰醋酸(分析純)，加超純水至500ml,貼上標(biāo)貼，室溫儲(chǔ)存。此溶液有效使用期限為三個(gè)月。（溶液配置臺(tái)帳見(jiàn)附件）漂洗液：量取100ml乙醇(分析純)，50ml冰醋酸(分析純)，加超純水至1000ml,貼上標(biāo)貼，室溫儲(chǔ)存。此溶液有效使用期限為三個(gè)月。（溶液配置臺(tái)帳見(jiàn)附件）輔染液：稱取10g重鉻酸鉀(分析純)，2ml硝酸(分析純)加適量超純水溶解，定容至200ml。用前40倍稀釋。貼上標(biāo)貼，室溫儲(chǔ)存。此溶液有效使用期限為三個(gè)月。（溶液配置臺(tái)帳見(jiàn)附件）銀染液：稱取2.04g硝酸銀(分析純)加超純水溶解至1000ml,貼上標(biāo)貼，室溫儲(chǔ)存。此溶液有效使用期限為三個(gè)月。（溶液配置臺(tái)帳見(jiàn)附件）顯色液：量取0.5ml甲醛(分析純),30g碳酸鈉(分析純)加適量的超純水,定容至1000ml,貼上標(biāo)貼，室溫儲(chǔ)存。此溶液有效使用期限為三個(gè)月。（溶液配置臺(tái)帳見(jiàn)附件）終止液：量取10ml冰醋酸(分析純)加超純水至1000ml,貼上標(biāo)貼，室溫儲(chǔ)存。此溶液有效使用期限為三個(gè)月。（溶液配置臺(tái)帳見(jiàn)附件）九.標(biāo)準(zhǔn)品（or對(duì)照品）：標(biāo)準(zhǔn)品:Fermentas公司蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)品＃sm0671、＃sm0441,4℃保存。(為什么不保存在-20C?)十.標(biāo)準(zhǔn)品驗(yàn)證：對(duì)不同批次的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行各條帶遷移率的驗(yàn)證。將上一批合格的標(biāo)準(zhǔn)品與新一批標(biāo)準(zhǔn)品一起電泳判斷各條帶的遷移率是否一致。十一．程序：制膠配膠裝板：以一塊塑料片、一塊厚玻板、一塊薄玻板的順序裝入制膠器各裝12塊（裝板都往左上方向按）裝上蓋子，對(duì)稱擰緊螺母制備分離膠：（100ml，12塊凝膠的量）分離膠濃縮膠凝膠濃度8％12%15%5％總體積100ml100ml100ml30ml試液/ml超純水46.4332520.530%丙烯酰胺26.64050051.5MTris·HClpH8.82525251MTris·HClpH6.83.7510%SDS1110.310%過(guò)硫酸胺1110.3TEMED0.060.040.040.03注：分離膠濃度與分離范圍關(guān)系：凝膠濃度%分子量范圍kDa6>250870-2501230-7015<30灌入分離膠后，再灌入無(wú)水乙醇(不是水?)至液面平，避免氣泡。待分離膠聚合（約45min）后，倒去無(wú)水乙醇并用純水沖洗，用濾紙吸去殘留的純水，再加入濃縮膠（配方見(jiàn)上表），根據(jù)需要插入樣品梳，避免氣泡出現(xiàn)。30min后待濃縮膠聚合后便可使用（如果暫時(shí)不使用裝入密封袋加入適量的1×電泳緩沖液于4℃保存，最長(zhǎng)保存一周，下次使用時(shí)取出膠室溫平衡30min后方可使用電泳裝板：拔出樣品梳將薄板裝入鉑金絲裝入電泳槽。將1×電泳緩沖液倒入電泳槽（陰極液的液面應(yīng)高于進(jìn)樣孔，陽(yáng)極液的液面應(yīng)在槽的2/5的高度）。樣品處理：將樣品放在振蕩混勻器上混勻30s，如果混不勻的應(yīng)使用200ul移液槍將樣品反復(fù)吹打直至充分混勻。（如有難溶沉淀,12000rpm/min5min離心取上清）根據(jù)之前蛋白含量檢測(cè)結(jié)果，蛋白濃度>0.8mg/ml的50ul樣品加入50ul2×還原緩沖液，蛋白濃度<0.8mg/ml的50ul樣品加入10ul6×還原緩沖液將樣品放在振蕩混勻器上混勻10s,放入100℃12000rpm/min離心5min加樣：在加樣孔中加入處理好的樣品加樣量以及加樣順序如下：點(diǎn)樣順序&濃度要求：（以三個(gè)樣品為例）M123123bsabsabsa2ug10ug1ug5ug10ug注：分子量檢測(cè)上樣量為2～3ug/孔，純度檢測(cè)上樣量為>10ug/孔電泳：接通電源，先恒壓100V開(kāi)始電泳，30min后將電壓調(diào)至1500V(!!!)，（讓溴芬藍(lán)跑到，但不能跑出去）染色：考馬氏亮藍(lán)法（一塊膠的量）染色：將跑完電泳的膠撥下泡入200ml考馬氏亮藍(lán)染色液放入微波爐高火加熱1min放在搖床上以25rpm/min染色30min脫色：倒去染色液倒入150ml脫色液放入微波爐高火加熱1min再放在搖床上以25rpm/min脫色30min倒去脫色液再重新倒入150ml新鮮脫色液，繼續(xù)脫色1h倒去脫色液再重新倒入150ml新鮮脫色液，繼續(xù)脫色1h倒去脫色液讓膠保存在水中。銀染：（一塊膠的量）固定：將做完電泳的凝膠取下用超純水漂洗２秒,再將凝膠浸入固定液中,在搖床上緩慢搖動(dòng)5min,使膠泛白．輔染：將固定完的膠用超純水漂洗２秒，倒去水加入輔染液在搖床上緩慢搖動(dòng)１０min．清洗：倒去輔染液，用超純水清洗３次，每次５min．（洗去有機(jī)物與鹽，使膠與水有一種融合的感覺(jué)．）銀染：倒去超純水，加入銀染液在搖床上緩慢搖動(dòng)１０min．清洗：倒去銀染液用超純水漂洗２秒．顯色：將膠浸入顯影液中顯色１０min．終止：加入終止液終止。十二.結(jié)果計(jì)算與分析：電泳凝膠經(jīng)掃描交于相關(guān)負(fù)責(zé)人進(jìn)行純度、分子量分析,純度應(yīng)大于90%，分子量應(yīng)為理論值的±10％才能制備抗體。十三.注意事項(xiàng)：1.樣品：樣品上樣應(yīng)吸取處理后的上清，避免吸底部的沉淀物。2.拖尾,紋理現(xiàn)象:需離心或降低膠濃度；3.蛋白帶過(guò)寬:上樣量過(guò)多。4.丙稀酰胺有毒性,配膠時(shí)需戴手套；5.蛋白質(zhì)與SDS(濃度>1mmol/L)結(jié)合重量比1:1.4,為充分結(jié)合重量比為1:4或1:3，B-ME終濃度為4-5%。6.因?yàn)楸０肪哂腥苊浶缘奶攸c(diǎn)故溶解時(shí)須加入少量的水待溶解后定容。配置時(shí)應(yīng)充分?jǐn)嚢璨⒈芄?。銀染注意點(diǎn)：7