第第頁(yè)4—香豆酸：輔酶A連接酶（4—coumarate:CoAligase，4CL）試劑盒說(shuō)明書4香豆酸：輔酶A連接酶（4coumarate:CoAligase，4CL）試劑盒說(shuō)明書微量法100管/48樣正式測(cè)定前務(wù)必取23個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做推測(cè)定測(cè)定意義：4CL是連接苯丙酸途徑與木質(zhì)素特異合成途徑的關(guān)鍵酶，重要催化肉桂酸生成相應(yīng)的肉桂酸輔酶A酯，是合成木質(zhì)素與其他苯丙烷類化合物的代謝流向調(diào)控點(diǎn)。該酶重要存在于高等植物、酵母和菌類中，討論該酶可以探討多種生物細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中木質(zhì)素沉積的代謝機(jī)理，為削減水果石細(xì)胞含量而提高其品質(zhì)供給依據(jù)。測(cè)定原理：4CL催化4香豆酸和CoA生成4香豆酸CoA，在333nm下測(cè)4香豆酸CoA生成速率，即可反映4CL活性。需自備的儀器和用品：紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板（UV板）、研缽、冰和蒸餾水。試劑的構(gòu)成和配制：提取液：100mL×1瓶，4℃保管；試劑一：液體25mL×1瓶，4℃保管；試劑二：粉劑×2瓶，20℃保管；粗酶液提?。杭?xì)菌或培育細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；依照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：提取液體積（mL）為500～1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液），超聲波碎裂細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；8000g4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。組織：依照組織質(zhì)量（g）：提取液體積（mL）為1：5～10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。測(cè)定步驟：1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀40℃預(yù)熱30min以上，調(diào)整波長(zhǎng)至333nm，蒸餾水調(diào)零。2、準(zhǔn)備96孔UV板一塊（非一般酶標(biāo)板，一般酶標(biāo)板只能透過(guò)可見光，不能透過(guò)紫外光，檢測(cè)波長(zhǎng)小于340nm務(wù)必使用UV板）。3、樣本測(cè)定（1）在試劑二中加入5mL試劑一充足溶解混勻，置于40℃水浴預(yù)熱10min；現(xiàn)配現(xiàn)用（配好后24h內(nèi)用完）；（2）對(duì)比管：在微量石英比色皿或96孔UV板中加入10μL樣本和190μL試劑一，混勻，立刻記錄333nm處40℃反應(yīng)30min后的吸光值A(chǔ)1、（3）測(cè)定管：在微量石英比色皿或96孔UV板中加入10μL樣本和190μL試劑二，混勻，立刻記錄333nm處40℃反應(yīng)30min后的吸光值A(chǔ)2，計(jì)算ΔA=A2A1、每個(gè)測(cè)定管設(shè)一個(gè)對(duì)比管。4CL活性計(jì)算：a.用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：?jiǎn)挝欢x：每mg組織蛋白每分鐘生成1nmol4香豆酸輔酶A定義為一個(gè)酶活力單位。4CL（nmol/min/mgprot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷（V樣×Cpr）÷T=31.75×ΔA÷Cpr（2）按樣本鮮重計(jì)算：?jiǎn)挝欢x：每g組織每分鐘生成1nmol4香豆酸輔酶A定義為一個(gè)酶活力單位。4CL（nmol/min/g鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷（W×V樣÷V樣總）÷T=31.75×ΔA÷W（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：?jiǎn)挝欢x：每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘生成1nmol4香豆酸輔酶A定義為一個(gè)酶活力單位。4CL（nmol/min/104cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷（500×V樣÷V樣總）÷T=0.063×ΔAV反總：反應(yīng)體系總體積，2×104L；ε：4香豆酸輔酶A摩爾消光系數(shù)，2.1×104L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.01mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時(shí)間，30min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬(wàn)。b.用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：?jiǎn)挝坏亩x：每mg組織蛋白每分鐘生成1nmol的4香豆酸輔酶A定義為一個(gè)酶活力單位。4CL（nmol/min/mgprot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷（V樣×Cpr）÷T=63.49×ΔA÷Cpr（2）按樣本鮮重計(jì)算：?jiǎn)挝坏亩x：每g組織每分鐘生成1nmol4香豆酸輔酶A定義為一個(gè)酶活力單位。4CL（nmol/min/g鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷（W×V樣÷V樣總）÷T=63.49×ΔA÷W（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：?jiǎn)挝坏亩x：每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘生成1nmol4香豆酸輔酶A定義為一個(gè)酶活力單位。4CL（nmol/min/104cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷（500×V樣÷V樣總）÷T=0.127×ΔAV反總：反應(yīng)體系總體積，2×104L；ε：4香豆酸輔酶A摩爾消光系數(shù)，2.1×104L/mol/