細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法的研究進(jìn)展

細(xì)胞死亡是由基因控制的、高度有序的細(xì)胞活動(dòng)死亡過(guò)程，即過(guò)程性細(xì)胞死亡（pcd）。細(xì)胞在一定的生理或病理狀態(tài)下,遵循自身的程序,自己結(jié)束自己生命的過(guò)程,最后細(xì)胞脫落離體或裂解為若干凋亡小體,而被其他細(xì)胞吞噬,不導(dǎo)致炎癥反應(yīng)。細(xì)胞凋亡不受到外損傷因素直接導(dǎo)致的被動(dòng)改變而屬機(jī)體自身的生理活動(dòng),是一種基因指導(dǎo)的生物過(guò)程,是對(duì)外部或內(nèi)部的死亡信號(hào)作出的反應(yīng),貫穿從受精、發(fā)育、成熟、衰老的整個(gè)生命過(guò)程。近年來(lái)一直是生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域各專業(yè)的研究熱點(diǎn)。隨著對(duì)凋亡研究的不斷深入,各種各樣檢測(cè)凋亡的新技術(shù)和新方法相繼建立,因此在我們的研究中選擇哪種凋亡檢測(cè)方法非常關(guān)鍵。本文就細(xì)胞凋亡的概況及四種細(xì)胞凋亡的檢測(cè)方法做一下比較,以期為將來(lái)的研究打下理論基礎(chǔ)。1凋亡受體的激活Kerr等(1972年)根據(jù)形態(tài)學(xué)的變化,首先提出和描述了一種不同于細(xì)胞壞死的死亡方式即細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡的發(fā)生是一個(gè)很復(fù)雜的過(guò)程,基本過(guò)程大體可以分為:起始階段、效應(yīng)階段和清除階段。它的發(fā)生是漸進(jìn)性分階段的過(guò)程,我們可以對(duì)其事件的發(fā)生大致排一個(gè)先后順序:首先是凋亡受體的激活或凋亡誘導(dǎo)因子的活化,然后通過(guò)不同途徑進(jìn)行傳導(dǎo),接下來(lái)是線粒體的變化及其caspases的活化,這是凋亡的前期事件;接著隨著活化核酸內(nèi)切酶激活,細(xì)胞出現(xiàn)凋亡特有的表現(xiàn):磷脂酰絲氨酸外翻、細(xì)胞皺縮、染色質(zhì)凝集等,直至形成凋亡小體。細(xì)胞凋亡的特征:早期形態(tài)學(xué)改變是細(xì)胞皺縮,細(xì)胞體積減小,繼而細(xì)胞核染色質(zhì)濃聚、固縮,聚集在核膜周邊,呈新月?tīng)?、塊狀活破裂狀;然后是胞漿濃縮、胞膜起泡,最終細(xì)胞核裂解成若干碎片,細(xì)胞膜將胞質(zhì)和染色質(zhì)斷片包裹,胞漿內(nèi)形成多個(gè)膜結(jié)構(gòu)尚完整的“小泡”及“凋亡小體”。這不同于細(xì)胞壞死表現(xiàn)為細(xì)胞膜通透性增高,致使細(xì)胞腫脹,細(xì)胞器變形腫大,最后細(xì)胞溶解破裂,溶酶體酶泄漏,并常引起炎癥反應(yīng)。細(xì)胞凋亡在生化學(xué)上表現(xiàn)為DNA瓊脂糖凝膠電泳呈梯狀條帶;細(xì)胞凋亡無(wú)炎癥反應(yīng)。死亡的細(xì)胞碎片很快被巨噬細(xì)胞或鄰近細(xì)胞清除,不留瘢痕,不影響其他細(xì)胞的正常功能。2檢測(cè)細(xì)胞死亡的方法2.1電鏡觀察細(xì)胞凋亡電鏡形態(tài)學(xué)檢測(cè)能夠?yàn)榧?xì)胞凋亡提供直觀的證明,是觀察細(xì)胞形態(tài)變化的最好方法,可清楚地觀察到細(xì)胞核及亞結(jié)構(gòu)其變化。通過(guò)電鏡可以觀察到有典型的凋亡細(xì)胞出現(xiàn),其特征是細(xì)胞核體積縮小,染色質(zhì)濃縮致密,并沿核膜分布形成新月體狀,細(xì)胞膜微絨毛消失,但細(xì)胞漿內(nèi)的各種細(xì)胞器基本正常。而普通光學(xué)顯微鏡只可以觀察到細(xì)胞凋亡的大體形態(tài)胞膜起泡現(xiàn)象和凋亡小體,但凋亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化大多發(fā)生在超微結(jié)構(gòu),因此用光鏡觀察難以令人滿意。電鏡形態(tài)學(xué)觀察是迄今為止判斷凋亡最經(jīng)典、最可靠的方法,被認(rèn)為是確定細(xì)胞凋亡的金標(biāo)準(zhǔn)。操作方法:取2mm×2mm×2mm的肌組織塊,固定,脫水,浸透,包埋,固化,切片,染色等步驟,透射電鏡下觀察。對(duì)其過(guò)程中的各項(xiàng)條件更加嚴(yán)格、更加精細(xì)。電鏡檢測(cè)細(xì)胞凋亡的缺點(diǎn)是:(1)只能定性,不能定量;(2)切片標(biāo)本處理過(guò)程復(fù)雜,設(shè)備相對(duì)昂貴,對(duì)檢查者的技術(shù)水平要求較高。此方法是判斷細(xì)胞有無(wú)凋亡發(fā)生的一種簡(jiǎn)便方法,且費(fèi)用低廉。缺點(diǎn):(1)特異性較差,特征性的(180~200)bpDNA梯帶的出現(xiàn)并非凋亡所獨(dú)有,另外在某些罕見(jiàn)的情況下細(xì)胞發(fā)生凋亡可無(wú)DNA斷裂;(2)不易定量;(3)靈敏性較差,耗時(shí)長(zhǎng),且要求大量細(xì)胞同時(shí)發(fā)生凋亡才能使電泳清晰2.3凋亡的分析方法(1)流式細(xì)胞儀的工作原理。用流式細(xì)胞術(shù)分析檢測(cè)細(xì)胞凋亡時(shí),必須用熒光染料對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色。常用的染料有碘化丙啶(P1),溴化乙啶(EB),丫啶橙,Hoechst33258等。經(jīng)熒光染料標(biāo)記過(guò)的細(xì)胞樣品要求制成單細(xì)胞懸液,以一定的流速經(jīng)過(guò)噴嘴,流速的選擇與檢測(cè)的目的有關(guān),當(dāng)液體剛好經(jīng)過(guò)光源發(fā)出的激光形成的聚焦區(qū),此時(shí),標(biāo)記的熒光染料在激發(fā)光的激發(fā)下發(fā)射出特異顏色的熒光信號(hào)和散射光信號(hào),信號(hào)的強(qiáng)弱與細(xì)胞內(nèi)待測(cè)組分的含量呈正比。熒光信號(hào)和散射光信號(hào)經(jīng)過(guò)光電倍增管和光電探測(cè)器接收后轉(zhuǎn)換成電脈沖,送入計(jì)算機(jī)處理,應(yīng)用不同的分析軟件可分析樣品的各種參數(shù),最后以直方圖或三維圖的形式顯示出來(lái)。此外,還可以用不同的標(biāo)記物進(jìn)行雙參數(shù)、三參數(shù)、甚至多參數(shù)的分析。另外,運(yùn)用流式細(xì)胞儀可根據(jù)細(xì)胞的形態(tài)或標(biāo)記染料的熒光信號(hào)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分選,以便下一步進(jìn)一步研究的需要。目前在基礎(chǔ)研究中,凋亡的定量分析主要依靠流式細(xì)胞術(shù)。流式細(xì)胞術(shù)是檢測(cè)細(xì)胞凋亡的有力工具,具有分析精確、重復(fù)性好、費(fèi)用低廉、分析速度快等優(yōu)點(diǎn),再者具有檢測(cè)的細(xì)胞數(shù)量大、可定量分析群體細(xì)胞的凋亡以及可同時(shí)進(jìn)行其他相關(guān)分析的特點(diǎn)。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡細(xì)胞的方法主要包括以下三個(gè)方面:形態(tài)學(xué)的檢測(cè)、DNA含量分析、DNA降解分析(斷裂點(diǎn)標(biāo)記法)。(2)形態(tài)學(xué)的檢測(cè)流式細(xì)胞術(shù)形態(tài)學(xué)檢測(cè)的兩個(gè)基本參數(shù)6:前向散射(PSC)反映細(xì)胞大小,側(cè)向散射(SSC)與細(xì)胞內(nèi)粒子性質(zhì)有關(guān),反映細(xì)胞的均質(zhì)性。凋亡細(xì)胞一般都出現(xiàn)細(xì)胞膜皺縮,核解聚,凋亡小體形成,胞漿濃縮,體積減小等形態(tài)學(xué)上的特征,經(jīng)過(guò)流式細(xì)胞儀的前向角散射(forwardscatter,FSC)和側(cè)向散角射(sidescatter,SSC)分析后,即可區(qū)分出凋亡細(xì)胞和正常細(xì)胞,凋亡細(xì)胞的典型特征是前向角散射下降。由于細(xì)胞凋亡或壞死均有細(xì)胞內(nèi)碎片增多,故SSC均高于正常。(3)DNA含量分析1)單參數(shù)分析PI一步染色法:收集細(xì)胞,PBS洗滌2次,冰凍70%乙醇固定,碘化丙啶(PI)染色,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞DNA含量。細(xì)胞經(jīng)低滲緩沖液或乙醇、TritionX-100處理后通透性增強(qiáng),胞膜上會(huì)出現(xiàn)小的漏洞,由于細(xì)胞凋亡后DNA斷裂,在洗滌和染色過(guò)程中小片斷DNA會(huì)從細(xì)胞內(nèi)漏出,使細(xì)胞DNA含量低于正常的二倍體含量。用染色后分析,會(huì)在二倍體峰前出現(xiàn)一個(gè)亞二倍體峰,即AP峰(apoptosispeak),可根據(jù)此峰的高低或面積計(jì)算凋亡細(xì)胞的百分率。2)雙參數(shù)分析通常用Hoechs-PI雙染法:正常細(xì)胞對(duì)其有拒染性,熒光著色淺,凋亡細(xì)胞主要攝取Hoechs-PI染料,呈強(qiáng)藍(lán)色熒光,而壞死細(xì)胞主要攝取Pl而呈紅色熒光,這樣就可以根據(jù)熒光強(qiáng)度區(qū)分正常細(xì)胞、凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞。DNA含量分析法快速、準(zhǔn)確,簡(jiǎn)單易行,所需樣本少,可大批量定量檢測(cè)凋亡標(biāo)本。另外,還可同時(shí)進(jìn)行細(xì)胞表面標(biāo)志檢測(cè)以明確發(fā)生凋亡的細(xì)胞種類。缺點(diǎn):(1)敏感性不高,首先凋亡早期雖然有DNA裂點(diǎn)出現(xiàn),但尚未出現(xiàn)DNA片斷的大量丟失,因此該法不能檢測(cè)出早期凋亡;其次,發(fā)生于S期或G2M期的凋亡細(xì)胞即使有DNA片斷的丟失,也不低于二倍體細(xì)胞的DNA含量。(2)特異性不強(qiáng),一部分壞死細(xì)胞碎片可呈現(xiàn)低熒光,位于二倍體峰前,可導(dǎo)致誤檢。(4)DNA降解分析(斷裂點(diǎn)標(biāo)記法)細(xì)胞凋亡的最后階段是形成DNA片段,DNA斷裂點(diǎn)法檢測(cè)的即是DNA的斷裂片段,即標(biāo)記DNA斷裂的3’-羥基末端,常采用由DNA聚合酶I催化的原位缺口轉(zhuǎn)移(ISNT)或用TdT介導(dǎo)的dUTP原位缺口末端標(biāo)記TUNEL技術(shù)。標(biāo)記后再進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)。特異性敏感性均比單獨(dú)使用某種技術(shù)有所提高。2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡TUNEL法是利用末端轉(zhuǎn)移酶TdT將標(biāo)記的脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移到DNA缺口或3’羥基末端上,通常使用的核苷酸為dUTP,標(biāo)記物為地戈辛生物素、熒光素等,標(biāo)記后的樣品與相應(yīng)的酶聯(lián)抗體作用后,可催化底物產(chǎn)生顏色反應(yīng)在普通顯微鏡下觀察。樣品被熒光素標(biāo)記可直接在熒光顯微鏡下觀察或激光共聚焦顯微鏡下觀察或采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。后續(xù)有研究對(duì)其加以改進(jìn),采用不同的修復(fù)方法與修復(fù)液,結(jié)果經(jīng)改進(jìn)后TUNEL法能特異顯示凋亡細(xì)胞核為棕黃色,陰性對(duì)照片無(wú)棕色反應(yīng),正常細(xì)胞或繁殖細(xì)胞核為藍(lán)色。操作方法:取材,可以制備成石蠟切片、冰凍切片、細(xì)胞懸液等,繼而根據(jù)所購(gòu)買(mǎi)的試劑盒按上面的說(shuō)明操作。TUNEL法檢測(cè)10、11、12細(xì)胞凋亡最為敏感、特異的方法,可量化凋亡細(xì)胞,動(dòng)態(tài)觀察凋亡細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化以及與細(xì)胞表型同時(shí)分析。其局限性為只能標(biāo)記中期及晚期凋亡細(xì)胞,不能檢測(cè)只發(fā)生DNA大片段(300bp以上)斷裂的凋亡細(xì)胞,也不能檢測(cè)斷裂末斷的準(zhǔn)確數(shù)量,因?yàn)槊總€(gè)裂斷末端結(jié)合的標(biāo)記分子的數(shù)量可因不同反應(yīng)動(dòng)力學(xué)而不同。3細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法的選擇通過(guò)對(duì)上述4種檢測(cè)細(xì)胞凋亡方法的比較研究發(fā)現(xiàn),目前實(shí)驗(yàn)室尚無(wú)一種完美的檢測(cè)細(xì)胞凋亡的手段。眾多的研究方法各具特色,也都有一定的局限性,所以在研究細(xì)胞凋亡時(shí),需結(jié)合既特異、靈敏,又能定量的多種手段來(lái)檢測(cè)。對(duì)于細(xì)胞凋亡的研究,采用幾種方法的聯(lián)合檢測(cè),可以為檢測(cè)凋亡提供更加全面、準(zhǔn)確、客觀的實(shí)驗(yàn)依據(jù),將具有重要的意義。更重要的是,充分了解各種方法的原理和特點(diǎn),才能對(duì)檢測(cè)結(jié)果做出合理的判斷和分析。2.2dna凝膠電泳在上世紀(jì)80年代DNA凝膠電泳一度被認(rèn)為是判定細(xì)胞凋亡的金標(biāo)準(zhǔn)之一。凋亡細(xì)胞的生化改變關(guān)鍵是DNA鏈被依賴的Mg、Ca離子激活內(nèi)切核酸酶從核小體間切斷,形成大約(180~200)bp的DNA片段(寡聚核小體)或它的倍數(shù)