大菱mdnad-loop序列遺傳多樣性分析

大靈靈丘馬其美爾。位于大西洋東北部的歐洲海岸。生長速度快，口感清新，經(jīng)濟價值高（雷錫林1983）。自1992年引進我國后,工廠化養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)發(fā)展極為迅速,目前年產(chǎn)量已達6萬多t,年總產(chǎn)值逾40億元。大菱鲆作為一個外來品種,受到引進親魚數(shù)量和種群來源的限制,再加上以往種質(zhì)保存和繁殖遺傳管理等工作沒有得到足夠重視,因長期累代養(yǎng)殖和近親交配造成的生長速度減慢、抗逆性降低和病害嚴(yán)重等性狀退化現(xiàn)象日益凸顯(申雪艷等2004;鄒曙明等2005;薛淑霞等2006;張曉君等2006),因此,對大菱鲆不同引進群體及現(xiàn)有養(yǎng)殖群體的遺傳背景進行分析,以便為相關(guān)種質(zhì)保存和繁殖遺傳管理工作提供依據(jù)已成為當(dāng)務(wù)之急。馬愛軍等(2008)、于飛等(2008)對引進不同地理群體的人工繁殖后代、關(guān)健等(2012)對3個國外引進群體和3個國內(nèi)累代繁養(yǎng)群體的群體形態(tài)特征分別進行了研究;申雪艷等(2004)鄒曙明等(2005)分別采用RAPD標(biāo)記和微衛(wèi)星標(biāo)記(SSR)等對不同引進地理群體的人工繁育和養(yǎng)殖后代的遺傳多樣性進行了研究。但是,尚未見有關(guān)直接采用核苷酸序列多態(tài)性對大菱鲆群體遺傳多樣性進行分析的報道。動物線粒體DNA(MitochondrialDNA,mtDNA)是一種環(huán)狀、共價閉合的超螺旋分子,其中,位于編碼脯氨酸Pro-tRNA和苯丙氨酸Phe-tRNA基因之間的D-loop區(qū),其進化速率是其他區(qū)段的5倍,被認(rèn)為特別適用于相近物種的種間或種內(nèi)的遺傳多樣性分析(黃志堅等2009;于旭蓉等2011;Nagataetal.1999)。本研究以分別從冰島(BP)和法國(FP)引進的兩個群體以及1個國內(nèi)累代繁養(yǎng)群體(JNP)合計60尾大菱鲆作為研究對象,采用DNA測序技術(shù)測定線粒體控制區(qū)(D-loop)的部分核苷酸序列,研究分析了3個群體的遺傳多樣性,從而為大菱鲆種質(zhì)保存、利用以及繁殖遺傳管理等提供更為豐富的數(shù)據(jù)。1材料和方法1.1群體取樣方法大菱鲆引進原種群體樣品取自山東青島智達海洋科技有限公司于2009年從法國和冰島引進的原種成魚(取樣時間為2009年7~12月),人工累代繁養(yǎng)群體樣品取自山東青島通用水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司保有的親魚群體(2009年11月取樣),每個群體各取樣20尾,共計60尾。1.2pcr擴增檢測d-loop區(qū)的序列及分析抽取試驗魚尾部靜脈血冷凍保存(-20℃),采用天根公司的TIANampMarineAnimalsDNA試劑盒和方法,經(jīng)優(yōu)化后提取基因組總DNA。參考GenBank中大菱鲆線粒體DNA全基因組(ID:EU419747.1)中D-Loop區(qū)的保守區(qū)域序列,設(shè)計合成1對特異引物(D-Loopforwardprimer:5′-CACACGATTCTCT-CATATTAGTAATTTAATAC-3′;D-Loopreverseprimer:5′-TTCCGGGGGGTTTTCAGG-3′)擴增線粒體DNAD-loop區(qū)部分序列。PCR反應(yīng)總體積為25μl,其中10×Buffer緩沖液2.5μl,dNTP(10mmol/μl)、上游引物(10pmol/μl)、下游引物(10pmol/μl)、模板DNA(100ng/μl)和TaqDNA聚合酶(2.5U/μl)各1μl,去離子滅菌水17.5μl。PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性4min;94℃變性30s,50℃退火30s,72℃延伸1min,35個循環(huán);72℃延伸10min,4℃保存。PCR擴增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測,PCR擴增產(chǎn)物純化后,委托山東濟南博尚公司進行雙向序列測定。測得的序列用ClustalX1.81程序(Thompsonetal.1997)進行序列重排和同源性比較,并輔以人工校對。利用DnaSP5.10(Libradoetal.2009)軟件計算各群體的單倍型多樣度(Hd)、平均核苷酸差異數(shù)(K)、核苷酸多態(tài)性(Pi);統(tǒng)計群體間的基因多樣度Hs、平均核苷酸差異數(shù)Kxy、基因分化系數(shù)Gst、地理單元件遺傳分化系數(shù)GammaST、遺傳分化指數(shù)Fst和群體間的基因流Nm值。應(yīng)用MEGA4.0(Tamuraetal.2007)軟件包分析序列特征、統(tǒng)計堿基組成和轉(zhuǎn)換與顛換值。應(yīng)用Kimura2-parameter模型計算遺傳距離。2結(jié)果與分析2.1臟器實際dna基含量測序得到的大菱鲆mtDNAD-loop部分序列長度為739~759bp,由于存在堿基插入/缺失現(xiàn)象,導(dǎo)致序列出現(xiàn)長度的多態(tài)性。序列堿基組成見表1。3個群體的堿基組成基本一致,T、C、A、G4種堿基的平均組成分別為27.7%、25.2%、29.6%和17.5%,無顯著變化。其中堿基G的含量顯著低于其他堿基的含量,符合脊椎動物線粒體DNA的共同特點(Wolstenholme1992)。A+T的含量(平均為57.3%)明顯高于C+G(平均為42.7%),表現(xiàn)出明顯的堿基組成偏向性,與其他已報道的鲹科和笛鯛科魚類和鱖魚的線粒體DNAD-loop序列的堿基含量相似(譚圍等2010;朱世華等2007;Zhaoetal.2006)。A、T含量較為接近,符合脊椎動物線粒體DNA基因片段堿基組成的特點(Wolstenholme1992)。60個樣本中共檢測到46個變異位點,其中17個是單一變異位點,29個為簡約信息位點。2.2大調(diào)節(jié)的核苷酸多態(tài)性3個群體中共檢測出56個單倍型,其中BP為20個,FP為19個,JNP為17個。各群體的單倍型多樣度(Hd)、平均核苷酸差異數(shù)(K)、核苷酸多態(tài)性(Pi)見表2。大菱鲆3個群體的平均單倍型多樣度為0.93333,其中BP最高,JNP最低;3個群體的平均核苷酸差異數(shù)為8.757,BP和FP較為接近,遠高于JNP;3個群體的平均核苷酸多態(tài)性為0.00849,其中BP和JNP較為接近,顯著低于FP。2.3法國群體與島嶼群體間的遺傳分化指數(shù)3個群體間基因流和遺傳分化系數(shù)的DnaSP5.10軟件統(tǒng)計結(jié)果見表3。法國群體與冰島和人工繁育群體間的基因流遠小于冰島群體與人工繁育群體間的基因流,并且法國群體與冰島和人工繁育群體間的遺傳分化指數(shù)也要高于冰島群體與人工繁育群體間的遺傳分化指數(shù)。結(jié)果表明,法國群體與冰島和人工繁育群之間的遺傳分化要高于冰島和人工繁育群體。2.4遺傳距離及遺傳距離群體間序列差異的大小反映了群體間親緣關(guān)系的遠近。表4是使用MAGA4.0軟件中Tamura-Nei模型計算的群體內(nèi)及群體間的遺傳距離。結(jié)果表明,冰島群體與人工繁育群體間的親緣關(guān)系較近,而法國群體與其余兩個群體間的親緣關(guān)系較遠,其中法國群體與人工繁育群體間的親緣關(guān)系最遠。3大負氧基因群間的遺傳分化生物群體遺傳多樣性是物種適應(yīng)多變的環(huán)境、維持長期生存和進化的遺傳基礎(chǔ),是評價生物資源狀況的重要依據(jù)和良種選育的基礎(chǔ)(楊宇暉等2010)。從本研究的結(jié)果來看,代表大菱鲆3個群體FP、BP和JNP核苷酸多樣度Pi的平均值分別為0.01134、0.00797和0.00616,略低于刀鱭(0.0262)(楊金權(quán)等2008)、棘頭梅童魚(0.0175)(鄭德鋒等2011)和尼羅羅非魚(0.0249)(吳長敬等2010),與已被證實遺傳多樣性較低的長江銅魚(0.00218)(嚴(yán)莉2005)和魚良白魚(0.00434)(楊博等2008)基本處于同一水平,這一結(jié)果與以往多個大菱鲆野生種群和養(yǎng)殖群體遺傳多樣性的同工酶、微衛(wèi)星和RAPD的評估結(jié)果一致(Blanqueretal.1992;Coughlanetal.1998;Bouzaetal.2002;申雪艷等2004)。所研究的3個大菱鲆群體中,兩個引進原種群體的Pi均高于人工累代繁養(yǎng)群體,其中FP的Pi值顯著高于JNP的Pi值,BP和FP平均核苷酸差異數(shù)K,也顯著高于JNP,說明本研究中的國內(nèi)累代繁養(yǎng)群體的遺傳多樣性水平低于兩個引進原種群體,這一結(jié)果與多數(shù)人工馴養(yǎng)魚類的檢測結(jié)果相一致(孟憲紅等2000;張德春2002;張德春等2004)。累代繁養(yǎng)后種群的遺傳變異度及遺傳多樣性水平會降低的原因,可能是人工馴養(yǎng)過程中建群親本數(shù)量少、遺傳漂變和近親雜交等因素不可避免地引起群體內(nèi)某些特定等位基因的喪失(韓曉磊等2009;楊博等2008)。單倍型多樣度Hd和核苷酸多樣度Pi通常情況下這二者具有一致性,Hd和Pi值越大,群體的多態(tài)程度越高,其遺傳多樣性越豐富,反之亦然(吳長敬等2010)。然而,盡管本研究中大菱鲆兩個原種引進群體BP和FP的Hd分別高達1.00000和0.95000,但是它們的Pi卻非常低,分別為0.00797和0.01134,與褐菖鲉(Hd=0.978,Pi=0.0192)(蘇天鳳等2012)和魚良白魚(Hd=0.996,Pi=0.00434)(楊博等2008)的結(jié)果相似。造成這種高Hd值、低Pi值的原因,可能是在演化過程中有較小有效種群快速擴張的階段,雖然通過變異積累了單倍型的多態(tài)性,但核苷酸序列的多樣化卻還未能積累到較高的程度(Avise2000;Grantetal.1998)。基因流(Nm)是兩個獨立種群間基因交流的量度。當(dāng)Nm值小于1時,表示種群間幾乎沒有基因交流,各種群內(nèi)的遺傳漂變可以引起種群間的遺傳分化;當(dāng)Nm值處于1~4之間時,種群間存在一定程度的基因交流,可以導(dǎo)致群體遺傳分化程度的降低(Allendorf1983;Neietal.2002)。本研究中,BP與FP之間以及FP與JNP之間的Nm均小于1,說明兩個群體之間幾乎不存在基因交流,存在著由遺傳漂變引起群體間遺傳分化的可能,同時BP與JNP間的Nm略大于1,說明BP與JNP間存在著一定的基因交流,這為今后將線粒體D-loop基因應(yīng)用于大菱鲆種質(zhì)資源的跟蹤與保護提供了新的依據(jù)。實際上,從所得出的3個種群遺傳分化指數(shù)(Fst)和群體間的遺傳距離可以看出,FP與JNP、FP與BP之間的遺傳分化指數(shù)和遺傳距離要遠高于BP與JNP,說明兩個原種引進群體間已經(jīng)出現(xiàn)了明顯的遺傳分化,與基因流(Nm)的分析結(jié)果相一致,同時法國引進群體與冰島及國內(nèi)累代繁養(yǎng)群體的親緣關(guān)系更遠,更具有引種價值。Blanquer等(1992)采用13種同工酶的17個位點對大菱鲆野生和養(yǎng)殖群體進行了研究。結(jié)果顯示,野生大菱鲆不同地理種群的生化遺傳變異水平非常低,野生種群及養(yǎng)殖群體之間的遺傳距離都很小;Coughlan等(1998)采用4個微衛(wèi)星標(biāo)記對愛爾蘭和挪威沿岸野生大菱鲆群體間遺傳差異進行了分析,發(fā)現(xiàn)兩個種群幾乎沒有地理分化;申雪艷等(2004)采用RAPD和SSR標(biāo)記分析發(fā)現(xiàn),我國從法國、英國和西班牙引進的大菱鲆群體間遺傳分化很弱,因此認(rèn)為我國大菱鲆種質(zhì)較為單一。DNA序列分析技術(shù)的發(fā)展使得直接從基因組特異區(qū)域的核苷酸組成上檢測魚類種群的遺傳變異成為常規(guī)手段(向文殿等2011)。與核DNA相比,mtDNA屬小分子DNA,結(jié)構(gòu)簡單,屬同源單拷貝DNA,并且mtDNA進化速率常比單拷貝核基因快,因此可用來分析親緣關(guān)系較近種群間的遺傳變異。與以往采用微衛(wèi)星等其他分子標(biāo)記所獲結(jié)論不同的是,本研究的分析結(jié)果說明,大菱鲆不同野生地理群體及人工養(yǎng)殖群體之間存在一定的遺傳分化,這一結(jié)果與不同產(chǎn)地的引進群體之間及其與國內(nèi)養(yǎng)殖群體間形態(tài)特征存在分化的結(jié)論相符合(于飛等2008;馬愛軍等2008;關(guān)健等2012),同時證明D-loop序列分析適用于大菱鲆