動(dòng)植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)胖虹彥20111052122細(xì)胞融合技術(shù)細(xì)胞融合(cellfusion)，是在自發(fā)或人工誘導(dǎo)下，兩個(gè)不同基因型的細(xì)胞或原生質(zhì)體融合形成一個(gè)雜種細(xì)胞。基本過程包括細(xì)胞融合形成異核體(heterokaryon)、異核體通過細(xì)胞有絲分裂進(jìn)行核融合、最終形成單核的雜種細(xì)胞

細(xì)胞融合技術(shù)的主要過程1.制備原生質(zhì)體2.誘導(dǎo)細(xì)胞融合3.篩選雜合細(xì)胞影響原生質(zhì)體制備的因素1.親本的選擇及預(yù)處理2.除壁酶的選擇3.酶濃度4.酶解溫度5.酶解時(shí)間6.滲透壓穩(wěn)定劑原生質(zhì)體融合方法1.生物學(xué)法（動(dòng)物細(xì)胞融合）2.化學(xué)融合劑法3.物理法原生質(zhì)體的再生使其細(xì)胞壁再生長(zhǎng)出來，恢復(fù)細(xì)胞原有形態(tài)和功能；主要影響的因素：1.菌種的特性2.原生質(zhì)體制備條件3.再生培養(yǎng)基成分4再生培養(yǎng)條件。融合子的選擇融合子的選擇主要咦靠?jī)蓚€(gè)親本的選擇性遺傳標(biāo)記，在選擇性培養(yǎng)基上，通過兩個(gè)親本的遺傳標(biāo)記互補(bǔ)而挑選出融合子。融合后的情況：1.真正的融合，即雜合體或重組體2.暫時(shí)融合，形成異合體。動(dòng)植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)動(dòng)植物細(xì)胞在體外條件下的存活或生長(zhǎng)，此時(shí)細(xì)胞不再形成組織。組織培養(yǎng)是指從機(jī)體內(nèi)取出組織或細(xì)胞，模擬機(jī)體內(nèi)生理?xiàng)l件，在體外進(jìn)行培養(yǎng)，使之生存和生長(zhǎng)。此時(shí)培養(yǎng)物可能保持組織分化和組織結(jié)構(gòu)功能。動(dòng)植物、微生物細(xì)胞的培養(yǎng)比較微生物動(dòng)物細(xì)胞植物細(xì)胞大小懸浮生長(zhǎng)營(yíng)養(yǎng)要求生長(zhǎng)速率代謝調(diào)節(jié)環(huán)境敏感細(xì)胞分化剪切應(yīng)力敏感傳統(tǒng)變異，篩選技術(shù)細(xì)胞或產(chǎn)物濃度1-10um可以簡(jiǎn)單快，倍增時(shí)間0.5-5小時(shí)內(nèi)部不敏感無低廣泛使用較高10-100um多數(shù)細(xì)胞需附著表面才能生長(zhǎng)非常復(fù)雜慢，倍增時(shí)間15-100小時(shí)內(nèi)部、激素非常敏感有非常高不常使用低10-100um可以，但易結(jié)團(tuán)，無單個(gè)細(xì)胞較復(fù)雜慢，倍增時(shí)間24-74小時(shí)內(nèi)部、激素能忍受廣泛范圍有高有時(shí)使用低動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)流程機(jī)體組織-切碎-酶解-離心收集-單細(xì)胞-培養(yǎng)-種子-液氮冷藏-復(fù)活培養(yǎng)-擴(kuò)大培養(yǎng)-反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)工藝

1、培養(yǎng)流程

（1）將動(dòng)物組織切成碎片；（2）用胰蛋白酶處理，分散組織得到單個(gè)細(xì)胞；（3）離心收集細(xì)胞；（4）植入營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，細(xì)胞增值到覆蓋瓶壁表面；（5）用胰蛋白酶消化使細(xì)胞從瓶壁脫落，再接種到培養(yǎng)瓶擴(kuò)大培養(yǎng)；

（6）獲得足夠量的細(xì)胞；（7）接入大規(guī)模培養(yǎng)生物反應(yīng)器；（8）回收產(chǎn)品。動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)工藝

2、培養(yǎng)方法

（1）分批培養(yǎng)；（2）流加培養(yǎng)；（3）半連續(xù)培養(yǎng)；（4）連續(xù)培養(yǎng)。動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)特性1.細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，易受微生物污染，培養(yǎng)時(shí)需用抗生素；2.動(dòng)物細(xì)胞較微生物大得多，無細(xì)胞壁，機(jī)械強(qiáng)度低，適應(yīng)環(huán)境能力差；3.培養(yǎng)過程需氧量少，且耐受強(qiáng)力通風(fēng)與攪拌；4.在機(jī)體中，細(xì)胞相互粘連以集群形式存在，培養(yǎng)過程具有群體效應(yīng)、錨地依賴性、接觸抑制性及功能全能性；5.培養(yǎng)過程產(chǎn)物分布于細(xì)胞內(nèi)外，反應(yīng)過程成本較高，產(chǎn)品價(jià)格昂貴；6.大規(guī)模培養(yǎng)時(shí)，不可套用微生物反應(yīng)的經(jīng)驗(yàn)；7.原代培養(yǎng)的細(xì)胞一般繁殖50袋即退化死亡。動(dòng)物細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)需求及培養(yǎng)基培養(yǎng)基A、物理性質(zhì)1、pH值：正常成纖維細(xì)胞：pH7.4—7.7；轉(zhuǎn)化細(xì)胞：pH7.0—7.4。酚紅的呈色：2、緩沖鹽：碳酸氫鈉3、滲透壓4、粘度紫色■紅帶藍(lán)■紅色■橙色■黃色■呈色7.87.67.47.06.5pH培養(yǎng)基B、培養(yǎng)基的組成1、氨基酸2、維生素3、鹽4、葡萄糖5、有機(jī)添加劑6、激素和生長(zhǎng)因素培養(yǎng)基C、血清1、常用血清：

小牛血清、胎牛血清、馬血清、人血清添加血清有助于細(xì)胞貼壁和生長(zhǎng)。2、血清提供的主要成分：

蛋白質(zhì)、多肽、激素、代謝物和營(yíng)養(yǎng)物、無機(jī)物細(xì)胞培養(yǎng)的環(huán)境要求A、支持物1、玻璃2、塑料3、微載體B、氣體交換1、氧氣：適合大氣氧含量，一般不需特別調(diào)整。2、二氧化碳：調(diào)整到5％。C、培養(yǎng)溫度1、最佳溫度的確定：a、動(dòng)物體溫；b、細(xì)胞所在身體部位；c、考慮一定的安全系數(shù)。2、細(xì)胞耐冷不耐熱細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)方式1.細(xì)胞懸浮培養(yǎng)法2.固定化培養(yǎng)法3.貼壁培養(yǎng)方法懸浮培養(yǎng)(Suspensionculture)

懸浮適應(yīng)細(xì)胞、源于循環(huán)系統(tǒng)的細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞等非貼壁依賴性細(xì)胞無需支撐面,細(xì)胞或細(xì)胞聚集體懸浮于液體培養(yǎng)基中增殖.懸浮培養(yǎng)是大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)的理想方式.固定化培養(yǎng)(Immobilizingculture)

固定化培養(yǎng)是一種包埋培養(yǎng)方式,適用于貼壁依賴性細(xì)胞和非貼壁依賴性細(xì)胞.它具有剪切力低、傳遞效果好和抗污染能力強(qiáng)、細(xì)胞生長(zhǎng)密度高、產(chǎn)物易于收集和分離純化等特點(diǎn)貼壁培養(yǎng)(Monolayerculture)

貼壁培養(yǎng)主要適用于貼壁依賴性細(xì)胞.一般源于實(shí)體組織的細(xì)胞需要相互依賴,需貼附于不起化學(xué)作用的物質(zhì)(玻璃或塑料等無活性物質(zhì))的表面生長(zhǎng)、生存和維持,并最終在附著面生長(zhǎng)至單層,鋪滿平面時(shí)便會(huì)發(fā)生接觸抑制.動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的條件控制培養(yǎng)裝置培養(yǎng)條件培養(yǎng)裝置的要求1.攪拌槳葉的形狀和攪拌轉(zhuǎn)速要有特殊設(shè)計(jì)2.培養(yǎng)系統(tǒng)必須保持長(zhǎng)期無菌的狀態(tài)3.培養(yǎng)罐、配管的材質(zhì)必須要對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞無毒害作用，通常都采用含鈦的不銹鋼培養(yǎng)裝置分類1.懸浮培養(yǎng)器2.貼壁培養(yǎng)器3.微載體懸浮培養(yǎng)器細(xì)胞懸浮培養(yǎng)器實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的培養(yǎng)裝置：液體懸浮培養(yǎng)瓶動(dòng)物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)生物反應(yīng)器帶帆形攪拌器的連續(xù)灌注系統(tǒng)培養(yǎng)反應(yīng)器實(shí)驗(yàn)室規(guī)模反應(yīng)器，4~40L，攪拌槳是用尼龍絲編織帶制成帆形，攪拌軸用磁力驅(qū)動(dòng)旋轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)速為20~50r/min，氧氣通過插入溶液中的硅膠管擴(kuò)散到培養(yǎng)液內(nèi)，以維持培養(yǎng)液內(nèi)一定的溶解氧水平。采用新鮮培養(yǎng)液連續(xù)加流，流出培養(yǎng)液通過旋轉(zhuǎn)過濾器分離細(xì)胞后排出。用于培養(yǎng)鼠類腫瘤細(xì)胞，每升培養(yǎng)液得到1.7×1012個(gè)細(xì)胞。工業(yè)規(guī)模裝置示意圖中試和工業(yè)規(guī)模的動(dòng)物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)反應(yīng)器：目前已有10m3規(guī)模的動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器用來培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞，生產(chǎn)單克隆抗體。關(guān)鍵是改進(jìn)攪拌槳和通氣裝置，減小剪切力。用螺旋槳取代渦輪式攪拌器，用擴(kuò)散滲透通氣裝置代替鼓泡空氣分散器。動(dòng)物細(xì)胞貼壁培養(yǎng)反應(yīng)器

大部分動(dòng)物細(xì)胞必須附著在固體或半固體表面才能生長(zhǎng)，細(xì)胞在載體表面上生長(zhǎng)并擴(kuò)展成一個(gè)單層，又稱單層培養(yǎng)。傳統(tǒng)方法：滾瓶用4~30L大小的成千上萬個(gè)滾瓶進(jìn)行動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)，來生產(chǎn)疫苗。比表面積小，0.35手工操作中孔纖維培養(yǎng)器由成束的中孔纖維管組成，每根中孔纖維管的內(nèi)徑為200μm，壁厚為50~75μm，管壁是半透性的多孔膜，O2與CO2可以自由地透過膜雙向擴(kuò)散，而大分子有機(jī)物不能透過。動(dòng)物細(xì)胞帖附在中空纖維管外壁生長(zhǎng)，可以方便地獲取營(yíng)養(yǎng)物和溶解氧。裝置內(nèi)可安裝成千根纖維管，比表面積大(>40)，溶解氧傳質(zhì)速率比懸浮培養(yǎng)器高3倍，為大規(guī)模動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)創(chuàng)造了條件。動(dòng)物細(xì)胞微載體懸浮培養(yǎng)反應(yīng)器用微珠作載體，使單層動(dòng)物細(xì)胞生長(zhǎng)于微珠表面，可在培養(yǎng)液中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。這種培養(yǎng)方式將單層培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)結(jié)合起來，是大規(guī)模動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)最常用方法。三個(gè)關(guān)鍵問題：具有合適的攪拌器，使載體在培養(yǎng)液內(nèi)懸浮流動(dòng)，而又要不因過高的剪切力而使動(dòng)物細(xì)胞受到損害；不能用傳統(tǒng)發(fā)酵罐那樣用空氣在培養(yǎng)液內(nèi)鼓泡充氧，而只能用擴(kuò)散方式來傳遞氧，以滿足所需的溶解氧濃度；在培養(yǎng)液中嚴(yán)格控制pH值，要求誤差小于0.05。動(dòng)物細(xì)胞微載體懸浮培養(yǎng)反應(yīng)器微珠可用葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺、明膠或甲殼質(zhì)等來制造，要求球徑均勻，徑差小于20~25μm，溶脹后密度在1.03~1.05g/ml，以便在反應(yīng)器內(nèi)經(jīng)緩慢攪拌后微載體能懸浮起來。微載體其表面化學(xué)成分可以在細(xì)胞培養(yǎng)過程中促進(jìn)貼壁依賴性細(xì)胞的附著和生長(zhǎng)。微載體的主要優(yōu)點(diǎn)是它們?cè)黾恿吮缺砻娣e，1個(gè)3升的微載體培養(yǎng)相當(dāng)于26個(gè)850cm2的滾瓶培養(yǎng)系統(tǒng)。它們可以使用在一個(gè)簡(jiǎn)單的滾瓶中或者高度控制的攪拌式生物反應(yīng)器中。帶中空纖維束的動(dòng)物細(xì)胞微微體懸浮培養(yǎng)反應(yīng)利用中空纖維作為通氣裝置的微載體懸浮培養(yǎng)反應(yīng)器：用直徑為2.5mm的聚四氟乙烯中空纖維管作為通氣裝置，空氣在管內(nèi)，氧分子通過半透性的管壁擴(kuò)散到培養(yǎng)液中，供動(dòng)物細(xì)胞生長(zhǎng)。錐形動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器

結(jié)構(gòu)：圓錐形筒體，內(nèi)裝一個(gè)可旋轉(zhuǎn)的塑料絲網(wǎng)氣腔，在氣腔的尖端部有螺旋槳攪拌器。氣腔內(nèi)有一圈氣體鼓泡管。操作：螺旋槳的翻動(dòng)使培養(yǎng)液循環(huán)流動(dòng)，并使載體懸浮于培