銀杏葉制劑中原花青素的定性研究

銀杏葉提取物具有很高的藥用價(jià)值。銀杏葉制劑和銀杏食品已經(jīng)成為世界上最受歡迎的天然植物之一。銀杏葉提取物具有拮抗血小板活化因子、清除自由基、抗炎、抗焦慮、抗過敏、擴(kuò)張血管、保護(hù)心腦血管及抗腫瘤等多種藥理學(xué)活性。銀杏內(nèi)酯和黃酮是產(chǎn)生上述活性的主要成分,也是銀杏葉提取物的主要有效成分和質(zhì)量控制指標(biāo)。除了上述2類成分外,銀杏葉提取物中還含有約7%的原花青素。原花青素具有廣泛的藥理學(xué)活性,包括抗氧化和自由基清除、抗菌和抗病毒、抗炎、抗輻射、保護(hù)心腦血管及抗腫瘤等,是銀杏葉制劑產(chǎn)生藥效的主要有效成分之一,但目前對于銀杏來源的原花青素研究甚少。原花青素是一種具有黃烷-3-醇結(jié)構(gòu)的植物多酚類化合物。目前常用于測定原花青素的方法有Folin-酚法、普魯士藍(lán)法、酒石酸亞鐵法、酸性丁醇法、香草醛法和4-二甲基氨基肉桂醛法。而HPLC法應(yīng)用于原花青素的研究主要包括原花青素單體化合物的測定,原花青素的分離及定性研究。Lazarus等建立了一種以硅膠為固定相,紫外為檢測器的NP-HPLC的方法,可以將食物中的原花青素按聚合度的大小進(jìn)行分離。Kelm等和Buendía等優(yōu)化了這一方法,將二元醇柱代替硅膠柱,以熒光檢測器代替紫外檢測器,使所得圖譜峰強(qiáng)度增加的同時(shí)也降低了干擾。原花青素在自然界中,其組成單體具有多種亞型,包括propelargonidin(單體為阿夫兒茶精和表阿夫兒茶精)、procyanidin(單體為兒茶素和表兒茶素)、prodelphinidin(單體為沒食子兒茶素和表沒食子兒茶素)、profisetinidin(單體為非瑟酮醇和表非瑟酮醇)、prorobinetinidin(單體為洋槐兒茶精和表洋槐兒茶精)。不同植物中的原花青素,其單體組成及比例都是不同的。大部分植物是以兒茶素和表兒茶素組成的原花青素為主,研究最多的葡萄籽原花青素中,這2種單體組成的原花青素占到了9成以上。而銀杏原花青素則主要由沒食子兒茶素和表沒食子兒茶素組成,即prodelphinidin,其比例高達(dá)85%。因此,應(yīng)用NP-HPLC方法聯(lián)合質(zhì)譜檢測,可以確定各色譜峰的相對分子質(zhì)量,用于不同來源原花青素的鑒別。本研究進(jìn)一步優(yōu)化了NP-HPLC法,來定性分析銀杏葉制劑中原花青素,為銀杏葉制劑中原花青素的質(zhì)量控制,以及鑒別摻假提供了思路和方法。1銀杏葉提取物葡萄籽提取物(含原花青素為95.28%):河南中冠健業(yè)生物科技有限公司;銀杏葉原花青素提取物:自制(含原花青素97.49%),批號110721;銀杏葉提取物(批號110117):浙江康恩貝制藥股份有限公司;銀杏葉片(TBN牌、YKN牌、CP牌、HNX牌、GJ牌)。Agilent高效液相色譜儀(美國Agilent公司);BS—210S天平(北京賽多利斯公司);離子阱質(zhì)譜儀(Thermo公司)。2方法和結(jié)果2.1發(fā)射光譜分析固定相為Phenomenex二元醇柱(250mm×4.6mm,5μm);流動(dòng)相為乙腈(A)-甲醇-水-乙酸(95∶3∶2,B);梯度洗脫程序:0～10min,0～12%B;10～10.01min,12%～15%B;10.01～30min,15%～45%B;30～35min,45%B;35～40min,45%～0B;體積流量為1.0mL/min;熒光激發(fā)波長276nm;發(fā)射波長316nm;進(jìn)樣量為20μL,記錄發(fā)射光譜圖進(jìn)行分析。由圖1可得,該色譜條件可以將銀杏葉原花青素和葡萄籽原花青素按聚合度的大小分離開來。由于銀杏原花青素單體組成較葡萄籽原花青素不同,因此各個(gè)聚體均出現(xiàn)2～3個(gè)峰。2.2葡萄籽原花青素相對分子質(zhì)量色譜條件:流動(dòng)相為乙腈-乙酸(98∶2,A)-甲醇-水-乙酸(69∶29∶2,B);洗脫梯度程序:0～35min,0～50%B;35～40min,50%～0B;體積流量0.6mL/min;柱溫35℃;進(jìn)樣量為10μL。紫外光譜檢測范圍為190～400nm;實(shí)時(shí)監(jiān)控波長為254nm。質(zhì)譜條件:ESI負(fù)離子模式檢測;碰撞氣為超純氦,鞘氣和輔助氣均為氮?dú)?壓力和體積流量分別為413.7kPa和6.7L/min;加熱毛細(xì)管溫度350℃;噴霧電壓3kV,毛細(xì)管電壓-15V;質(zhì)量掃描范圍為m/z100～1500。在線動(dòng)態(tài)采集豐度最高離子的二級質(zhì)譜,碰撞能量30%,采用ThermoFinniganXcalibur1.3工作站獲取及處理數(shù)據(jù)。由圖2可知,葡萄籽原花青素1～4號峰的相對分子質(zhì)量分別為577、865、1153、1442,根據(jù)這些相對分子質(zhì)量大小,可以推測出1～4號峰均由(表)兒茶素組成,見表1。由圖3可得,銀杏葉原花青素1號峰(m/z609)和2號峰(m/z593)為二聚體峰,3～5號峰(m/z917、881、897)為三聚體峰,6～8號峰(m/z1185、1201、1217)為四聚體峰,根據(jù)相對分子質(zhì)量推測,這些聚合體是由(表)兒茶素和(表)沒食子兒茶素共同組成的,或由(表)沒食子兒茶素單獨(dú)聚合組成的,但不存在單獨(dú)的(表)兒茶素組成的聚合體,見表1。2.3不溶性輔料取銀杏葉片各10片,研磨至細(xì)粉,用20%丙酮100mL、超聲輔助溶解,濾過,去除不溶性輔料。將濾液上樣于聚酰胺樹脂,上樣完成后用3～4倍體積的20%丙酮洗脫,棄去該部位;再用3～4倍體積的80%丙酮洗脫,得80%丙酮部位;將80%丙酮部位回收至無丙酮味,用等體積乙酸丁酯萃取2次,棄去有機(jī)層,回收水層至干;殘?jiān)眉状既芙?即得。2.4葉片出峰特征各制劑經(jīng)HPLC分析后,所得的特征圖譜比較相似:活性最高的二聚體2個(gè)峰出峰明顯,峰高及峰面積比例接近;三聚體峰以TBN銀杏葉片出峰最為明顯,HNX和GJ銀杏葉片出峰最不明顯。而幾種制劑的單體峰相差較多,以YKN和GJ銀杏葉片單體峰出峰更為明顯,CP和HNX銀杏葉片出峰最不明顯,見圖4。2.5摻假量對原花青素提取率的影響稱取4份銀杏葉提取物,分別為1.99、1.98、1.96、1.92g;依次加入葡萄籽提取物0.01、0.02、0.04、0.08g,即摻假量分別為0.5%、1.0%、2.0%、4.0%。上述樣本經(jīng)前處理后,分析原花青素的組成。由圖5可知,摻入葡萄籽原花青素的銀杏提取物HPLC特征峰發(fā)生了明顯的改變:(1)二聚體2個(gè)峰的特征發(fā)生改變:14min左右的峰較15.3min左右的峰出峰強(qiáng)度更加明顯、峰高更高、峰面積更大;(2)17.3min左右的峰出峰更加明顯;(3)上述2種改變的趨勢與葡萄籽原花青素加入量成正比。3pahs在銀杏葉提取物中的色譜特征之前的研究已經(jīng)證實(shí),通過NP-HPLC法可以將可可及草莓中的原花青素根據(jù)聚合度大小進(jìn)行分離。本研究通過HPLC-DAD-MS分析,也證實(shí)了葡萄籽原花青素是由(表)兒茶素組成的,銀杏原花青素則是由(表)兒茶素和(表)沒食子兒茶素共同組成的。此外,據(jù)已有的文獻(xiàn)報(bào)道,prodelphinidin僅發(fā)現(xiàn)存在于美國山核桃Caryaillionensis的髓心及銀杏葉中。而prodelphinidin的色譜特征峰與procyanidin差異較大,prodelphinidin中不同的聚合度基本有2～3個(gè)峰,而procyanidin每個(gè)聚合度只有1個(gè)峰。由此,筆者認(rèn)為通過NP-HPLC法可以快速的鑒別出銀杏葉制劑中是否有摻假行為。本研究中,當(dāng)向銀杏葉提取物中摻入葡萄籽原花青素后,其色譜特征發(fā)生明顯的改變:(1)14min左右出的峰強(qiáng)度增強(qiáng)、峰高增加、峰面積增大,其原因是該時(shí)間點(diǎn)葡萄籽原花青素二聚體出峰,銀杏原花青素[由2摩爾(表)沒食子兒茶素組成]二聚體也出峰,而15.3min左右僅銀杏原花青素另1個(gè)二聚體[由1摩爾(表)沒食子兒茶素和1摩爾(表)兒