分子生物學(xué)大題一、原核生物和真核生物基因組各自的特點(diǎn)：原核生物基因組：基因組通常僅由一條環(huán)狀雙鏈分子組成；結(jié)2.構(gòu)基因與調(diào)控序列以操縱子的形式組織在一起；基3.因組中重復(fù)序列很少；4結(jié).構(gòu)基因多為單拷貝；5基.因是連續(xù)的；6編.碼序列一般不會(huì)重疊；編7.碼區(qū)在基因組中所占的比例遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于真核基因組而小于病毒基因組；細(xì)菌基因組中存在可移動(dòng)序列。真核生物基因組：為雙鏈線狀且往往不是一條；結(jié)2構(gòu)基因?yàn)榫鷶嗔鸦?，并受一系列順式作用元件調(diào)控；結(jié)3構(gòu)菌基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為單順?lè)醋?；?編菌碼序列遠(yuǎn)多于編碼區(qū)；含5有菌大量重復(fù)序列和基因家族；末端具有端粒結(jié)構(gòu)；還7包菌括細(xì)胞器基因組。二、核酸分子雜交技術(shù)印跡（檢測(cè)）首先通過(guò)限制性核酸內(nèi)切酶降解樣品中，再經(jīng)凝膠電泳分離，將分離后的片段從凝膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素薄膜等上并固定，再用標(biāo)記過(guò)的探針進(jìn)行雜交，以檢測(cè)目的N印跡（檢測(cè)）應(yīng)用探針檢測(cè)特異的一種雜交技術(shù)，主要用于分析的轉(zhuǎn)錄或分子大小。其方法類(lèi)似于印跡雜交。印跡（檢測(cè)蛋白質(zhì)）將待檢測(cè)蛋白質(zhì)（或酶）經(jīng)電泳并染色后，轉(zhuǎn)移到濾膜上固定，再用“抗體抗原”免疫反應(yīng)或”結(jié)合反應(yīng)鑒別濾膜上的蛋白質(zhì)。三、擴(kuò)增技術(shù)基本原理：的半保留復(fù)制。2.反應(yīng)體系的基本成分：()模板：包括和N()特異性引物：是一段與模板鏈互補(bǔ)的寡核苷酸片段。()熱穩(wěn)定的聚合酶：耐熱的聚合酶。():包括、、、。()二價(jià)陽(yáng)離子：常用，調(diào)節(jié)聚合酶活性，影響引物退火、的特性。()緩沖液：一般使用，調(diào)節(jié)值，使反應(yīng)體系偏堿性；()一價(jià)陽(yáng)離子：一般為，促進(jìn)引物退火，高濃度抑制聚合酶活性。3基基本操作：()變性將待擴(kuò)增的模板加熱到4,使雙鏈解鏈為單鏈。()退火將溫度下降至5左右，引物與變性的模板利用堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合。()延伸在2下，聚合酶在合適的緩沖溶液中，以為底物，嚴(yán)格按照模板鏈堿基序列合成互補(bǔ)鏈，即從引物的3進(jìn)行循環(huán)，合成方向?yàn)?3。以上三步驟為一次循環(huán)，每循環(huán)一次，分子按指數(shù)增加，經(jīng)多次循環(huán)后即可達(dá)到大量擴(kuò)增片段的目的。應(yīng)用：用于目的基因的直接克?。粚⒛孓D(zhuǎn)錄與相偶聯(lián)()，構(gòu)建文庫(kù)；制作探針，進(jìn)行分子檢測(cè)等；用于基因表達(dá)與調(diào)控研究，如檢測(cè)；的多態(tài)性分析，如通過(guò)限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性來(lái)揭示堿基序列的差異；臨床上進(jìn)行遺傳及傳染性疾病的基因診斷；在制藥工業(yè)中篩選抗腫瘤的抗生素。四、基因敲除技術(shù)1基基因敲除的一般原理：()理論基礎(chǔ)：同源重組，發(fā)生在兩條雙鏈的同源序列之間，涉及的是大片段同源序列的交換。()技術(shù)基礎(chǔ)：胚胎干細(xì)胞(細(xì)胞)分離和體外培養(yǎng)技術(shù)。2.基因敲除的策略：（1）基因敲除載體構(gòu)建特點(diǎn)：具有與細(xì)胞中目標(biāo)基因同源的序列；帶有選擇性標(biāo)記基因，便于后續(xù)的篩選和富集。（）基因敲除載體導(dǎo)入細(xì)胞基因敲除載體導(dǎo)入細(xì)胞的方法：顯微注射法、電穿孔法、精子載體法、逆轉(zhuǎn)錄病毒法等。篩選與鑒定基因敲除載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，大部分細(xì)胞中并沒(méi)有整合入外源基因，或是發(fā)生了隨機(jī)整合，因此從眾多的細(xì)胞中篩選和鑒定出發(fā)生了同源重組的細(xì)胞是基因敲除的重要步驟。常用的篩選方法有兩類(lèi)：遺傳篩選法，包括正負(fù)篩選法（法）和正向篩選法；物理篩選法，主要是篩選方法?；蚯贸齽?dòng)物產(chǎn)生細(xì)胞經(jīng)體外遺傳修飾之后重新引入動(dòng)物胚胎，可以發(fā)育產(chǎn)生嵌合體或完全細(xì)胞來(lái)源的動(dòng)物。獲得基因敲除純合體：由于同源重組常常發(fā)生在一對(duì)染色體上中一條染色體中，所以如果要得到穩(wěn)定遺傳的純合體基因敲除模型，需要進(jìn)行至少兩代遺傳。五、正負(fù)篩選法和正向篩選法1正.負(fù)篩選法：定義：采用置換型載體，該載體含有正（基因，插入載體的同源序列）和負(fù)（基因，置于同源序列的外側(cè)）選擇基因各一個(gè)；同源重組時(shí)，載體的同源區(qū)發(fā)生重組，同源區(qū)以外部分將被切除，所以在同源重組時(shí)，基因?qū)⒈磺谐鴣G失。而在隨機(jī)整合時(shí)，所有的序列均保留。胸苷激酶蛋白（）可使無(wú)毒性的更昔洛韋轉(zhuǎn)變?yōu)槎拘院塑账岫鴼⑺兰?xì)胞，因而可用更昔洛韋篩選排除隨機(jī)整合的細(xì)胞株。在同源重組時(shí)，細(xì)胞對(duì)和更昔洛韋都有抗性，隨機(jī)整合時(shí)只對(duì)有抗性，而對(duì)更昔洛韋敏感，細(xì)胞將被殺死。未進(jìn)行任何方式整合的細(xì)胞則被殺死。用作正篩選，可得到含有基因的細(xì)胞株，然后再用更昔洛韋做負(fù)篩選，淘汰含有基因的細(xì)胞株，就可以得到不含基因的同源重組細(xì)胞株。法適用于任何基因的定向敲除。但除了產(chǎn)生同源重組外還可能發(fā)生隨機(jī)整合。2.正向篩選法定義：僅攜帶正選擇性標(biāo)記一種標(biāo)記基因，而且選擇性標(biāo)記基因缺乏自身的某個(gè)表達(dá)調(diào)控序列。載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，如果能發(fā)生同源重組，或隨機(jī)整合入細(xì)胞基因組內(nèi)并在整合位點(diǎn)附近恰巧存在相應(yīng)的表達(dá)調(diào)控序列，那么殘缺的選擇性標(biāo)記基因就能利用基因組上的表達(dá)調(diào)控序列得到表達(dá)；相反的，選擇性標(biāo)記基因無(wú)法得到表達(dá)。通過(guò)選擇性培養(yǎng)基的培養(yǎng)，表達(dá)了選擇性標(biāo)記基因的細(xì)胞就可以被篩選出來(lái)。正向篩選法可分為無(wú)啟動(dòng)子篩選法、無(wú)增強(qiáng)子篩選法和無(wú)篩選法。只適用于在細(xì)胞中能較好表達(dá)的基因。六、基因芯片技術(shù)基本原理：基因芯片又稱(chēng)芯片，其基本原理是將大量（通常每平方厘米點(diǎn)陣密度高于）探針?lè)肿樱ü押塑账岱肿樱┕潭ㄓ谥С治锷?，然后與標(biāo)記的樣品分子進(jìn)行雜交，通過(guò)檢測(cè)每個(gè)探針?lè)肿拥碾s交信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)而獲取樣品分子的數(shù)量和序列信息。2基主要步驟：（）芯片制備：以玻璃片或硅膠片為載體，采用原位合成和微距陣的方法，將寡核苷酸片段或作為探針按順序排列在載體上。（2）樣品制備：生物樣品一般不能直接與芯片反應(yīng)，須將樣品進(jìn)行提取、擴(kuò)增，獲取其中的蛋白質(zhì)或和N然后熒光標(biāo)記，以提高檢測(cè)的靈敏度和使用者的安全性。（）雜交反應(yīng)：樣品與芯片上的探針陣列進(jìn)行雜交。選擇合適的反應(yīng)條件能使生物分子間反應(yīng)處于最佳狀態(tài)中，降低錯(cuò)配率。（4）信號(hào)檢測(cè)和結(jié)果分析：雜交反應(yīng)后的芯片上各個(gè)反應(yīng)點(diǎn)的熒光位置、熒光強(qiáng)弱，經(jīng)過(guò)芯片掃描儀和相關(guān)軟件可以分析圖像，將熒光轉(zhuǎn)換成數(shù)據(jù)，即可獲得有關(guān)的生物信息。七、藥物定義：小干擾（）是一個(gè)長(zhǎng)到個(gè)核苷酸的雙股N可以阻斷異常蛋白的產(chǎn)生。作用機(jī)制：作用機(jī)制涉及干擾，干擾是由同源雙鏈（）誘導(dǎo)序列特異的目標(biāo)基因沉寂，阻斷基因活性的現(xiàn)象。作用特點(diǎn)：不僅能引導(dǎo)切割同源單鏈，而且可作為引物與靶結(jié)合并在聚合酶）作用下合成更多新的，新合成的再由切割產(chǎn)生大量的次級(jí)，從而使的作用進(jìn)一步放大，最終將靶完全降解。設(shè)計(jì)應(yīng)注意：①物種特異性②靶標(biāo)一般在區(qū)③的轉(zhuǎn)染效率5作反義藥物與傳統(tǒng)藥物的性質(zhì)和作用對(duì)象明顯不同，表現(xiàn)為:（）新的化學(xué)物質(zhì)核酸；（）新的藥物受體，N（）新的受體結(jié)合方式雜交；（）新的藥物受體結(jié)合后反應(yīng)如介導(dǎo)的靶的降解。6反作義藥物與傳統(tǒng)藥物相比具有以下優(yōu)點(diǎn)：（1特）異性較強(qiáng);（2信）息量較大;（反3義）藥物以核酸為靶點(diǎn)，與蛋白質(zhì)作為靶點(diǎn)比較，更易合理設(shè)計(jì)新藥物;（比4）傳統(tǒng)藥物更具選擇性及效率，副作用可能更少。干擾的作用特點(diǎn)（）具有高度特異性；（）具有高效性；（）受多基因控制；（）需介導(dǎo)：作用的靶向精確定位是依賴(lài)于與目的基因的堿基互補(bǔ)配對(duì)來(lái)實(shí)現(xiàn)的；（）對(duì)靶基因位點(diǎn)的選擇性;（6）放大效應(yīng)。八、雙向凝膠電泳技術(shù)（）雙向凝膠電泳：利用蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)與分子量差異分離蛋白質(zhì)。第一向：等電聚焦，利用蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的不同，在梯度膠內(nèi)進(jìn)行第一次分離。第二向：，沿著第一向垂直的方向通過(guò)蛋白質(zhì)分子量的大小進(jìn)行第二次分離，把復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物在二維平面上分離開(kāi)來(lái)。優(yōu)點(diǎn)：是目前常用的唯一能夠在一塊膠上分離數(shù)千種蛋白質(zhì)的方法，是目前蛋白質(zhì)組學(xué)研究中最為有效的蛋白質(zhì)分離技術(shù)。缺點(diǎn)：難以有效分離極酸、極堿性蛋白質(zhì)，極大、極小蛋白質(zhì)，及低豐度蛋白質(zhì)。膠內(nèi)酶解過(guò)程費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，難以與質(zhì)譜實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化聯(lián)用。九、酵母雙雜交系統(tǒng)基本概念：是一種用于研究蛋白質(zhì)相互作用的方法手段。它利用酵母細(xì)胞內(nèi)的真核表達(dá)系統(tǒng)，將兩種外源蛋白質(zhì)的基因分別與酵母轉(zhuǎn)錄因子的兩個(gè)功能結(jié)構(gòu)域融合，通過(guò)質(zhì)粒導(dǎo)入酵母細(xì)胞，以酵母細(xì)胞表型的改變作為外源蛋白是否發(fā)生相互作用的篩選標(biāo)志。典型的真核轉(zhuǎn)錄因子都含有二個(gè)結(jié)構(gòu)域結(jié)合結(jié)構(gòu)域（）和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（）。二個(gè)結(jié)構(gòu)域功能上相互獨(dú)立又互相依賴(lài)，只有結(jié)合才具完整活性。將片段和片段分別與待測(cè)的和蛋白片段（即和）結(jié)合，并分別構(gòu)建在個(gè)表達(dá)載體中，導(dǎo)入酵母細(xì)胞中共表達(dá)。由和蛋白形成的融合蛋白稱(chēng)為誘餌，由和蛋白形成的融合蛋白稱(chēng)為獵物或靶蛋白，被激活的、能顯示蛋白和蛋白之間相互作用的基因稱(chēng)為報(bào)告基因。通過(guò)對(duì)報(bào)道基因表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)，可鑒定作為“誘餌”和“獵物”的兩個(gè)蛋白質(zhì)之間是否存在相互作用。十、外源基因表達(dá)基本類(lèi)型.根據(jù)宿主細(xì)胞不同：原核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)、真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。.根據(jù)表達(dá)產(chǎn)物在宿主細(xì)胞生成的部位不同：胞內(nèi)表達(dá)、定位表達(dá)、分泌表達(dá)。.根據(jù)表達(dá)產(chǎn)物的溶解狀況不同：可溶性表達(dá)、包涵體表達(dá)。.根據(jù)表達(dá)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)狀況不同：非融合表達(dá)、融合表達(dá)。十一、外源基因表達(dá)（基因工程）的基本過(guò)程口訣：分、切、接、轉(zhuǎn)、篩、表。（）分離：提取和獲得目的基因和載體N（）切割：分別對(duì)目的基因和載體酶切；（）連接：用連接酶連接目的基因與載體，形成新的重組分子；（）轉(zhuǎn)化：用重組分子轉(zhuǎn)化受體（宿主）細(xì)胞；（）篩選：重組體在受體細(xì)胞中復(fù)制和遺傳；對(duì)轉(zhuǎn)化子篩選和鑒定；（）表達(dá)：對(duì)獲得外源基因的細(xì)胞或生物體通過(guò)培養(yǎng)，獲得所需的遺傳性狀或表達(dá)出所需要的產(chǎn)物。十二、外源基因?qū)氲姆椒?氯化鈣轉(zhuǎn)化法：將氯化鈣，或混合，沉淀形成包含且極小的不溶的鈣顆粒。大腸桿菌經(jīng)冰冷的處理，就成為感受態(tài)細(xì)菌，當(dāng)加入重組質(zhì)粒并突然由℃轉(zhuǎn)入2作短時(shí)間處理，質(zhì)粒就能進(jìn)入細(xì)菌；又稱(chēng)為熱休克法。.電穿孔法：用高電壓脈沖短暫作用也能顯著提高轉(zhuǎn)化效率，這稱(chēng)為電穿孔轉(zhuǎn)化法。3顯.微注射法：是在顯微鏡直視下，向細(xì)胞核內(nèi)直接注射外源基因。.陽(yáng)性脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染：應(yīng)用人工脂質(zhì)體包裝外源基因，再與靶細(xì)胞融合，或直接注入病灶組織，使之表達(dá)。.病毒感染法:病毒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移是通過(guò)感染方式完成基因轉(zhuǎn)移，即以病毒為載體,將外源目的基因通過(guò)基因重組技術(shù)，將其組裝于病毒上，讓這種重組病毒去感染受體宿主細(xì)胞，這種病毒稱(chēng)為病毒運(yùn)載體。補(bǔ)充：一、檢測(cè)的常用技術(shù)電泳酶切序列分析芯片生物信息學(xué)2單.核苷酸多態(tài)性的特征：是人類(lèi)基因組序列中最常見(jiàn)和最普遍的一種多態(tài)性。由單堿基的轉(zhuǎn)換、顛換、插入和缺失等變異引起。）1是人類(lèi)可遺傳變異中最常見(jiàn)的一種，發(fā)生頻率至少大于1%）2數(shù)量多、分布廣，在人類(lèi)基因中廣泛存在。）3具有遺傳穩(wěn)定性）具4有二態(tài)性）5可以建立單體型模型）部分位于基因內(nèi)部的可能會(huì)直接影響蛋白質(zhì)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)或基因表達(dá)水平。二、克隆載體必須具備的基本條件：.有自身的復(fù)制子，能獨(dú)立復(fù)制，目的基因插入不影響載體復(fù)制能力；.必須具備合適的酶切位點(diǎn)，最好含有多種限制酶的單一切點(diǎn)，多個(gè)限制酶的酶切位點(diǎn)也稱(chēng)多克隆位點(diǎn)（），在切點(diǎn)內(nèi)可以與外源進(jìn)行連接重組；.應(yīng)具有遺傳表型或篩選標(biāo)記，如對(duì)抗生素的抗性，噬菌斑的形成等；.載體分子量較小，可以攜帶足夠長(zhǎng)的外源N載體中均有一段不影響其復(fù)制和生長(zhǎng)的非必需區(qū)，將外源基因插入該非必需區(qū)，而載體本身不受影響。三、限制性?xún)?nèi)切酶具有的共同特性：）只降解雙鏈分子，不水解單鏈或2）每種酶有其特定的核苷酸序列識(shí)別位點(diǎn)3）酶的活性需要二價(jià)離子鎂來(lái)激活四、宿主細(xì)胞通常要滿足下列條件：①宿主細(xì)胞必須無(wú)限制性?xún)?nèi)切酶；②宿主細(xì)胞應(yīng)無(wú)重組能力，應(yīng)為重組缺陷型株；③易于轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)，為感受態(tài)細(xì)胞；④遺傳穩(wěn)定性好⑤目的基因功能缺陷，便于篩選；⑥符合安全標(biāo)準(zhǔn)，不具有感染寄生性。⑦蛋白水解酶基因缺陷或其表達(dá)低，降低對(duì)外源蛋白的降解。五、目的基因制備技術(shù)：化學(xué)合成法獲得已知基因聚合酶鏈反應(yīng)基因組文庫(kù)文庫(kù)獲得未知基因六、基因表達(dá)系列分析（）定義：是通過(guò)快速和詳細(xì)分析成千上萬(wàn)個(gè)來(lái)尋找出表達(dá)豐富度不同的標(biāo)簽序列，從而比較完整地獲得基因組的表達(dá)信息。能夠快速、全范圍提取生物體基因表達(dá)信息，對(duì)已知基因進(jìn)行量化分析。也能應(yīng)用于尋找新基因。主要過(guò)程：第一階段：文庫(kù)的構(gòu)建①以為引物將反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈，經(jīng)錨定酶（）酶（如m、I等）切后收集的3端部分。②將收集的3端等分為兩部分，分別同接頭、相連接。每一種接頭的結(jié)構(gòu)都由擴(kuò)增引物或的序列、標(biāo)簽酶識(shí)別位點(diǎn)和錨定酶識(shí)別位點(diǎn)三部分組成。標(biāo)簽酶（）是一種類(lèi)限制性?xún)?nèi)切酶，如等，它在距識(shí)別位點(diǎn)下游約的位置切割雙鏈。③連接產(chǎn)物以標(biāo)簽酶酶切后用酶補(bǔ)平5突出端，