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文檔簡介
原代培養(yǎng)細胞體外生存過程原代培養(yǎng)期
傳代期
衰退期細胞分離技術(shù)離心分離法機械分離法化學(xué)分散法細胞表面抗原(電泳、流式細胞儀)等培養(yǎng)細胞的純化自然純化人工純化酶消化法反復(fù)貼壁法機械刮除法克隆法培養(yǎng)基限定法流式細胞儀細胞凍存與復(fù)蘇基本原則:慢凍快融凍存凍存保護劑:甘油、二甲基亞砜(DMSO)
復(fù)蘇
37℃水浴中,30秒-1分鐘,充分搖動使其急速融化?;钚詸z測染色排除法
MTT比色法乳鼠腎細胞的原代培養(yǎng)實驗器材與試劑器材超凈工作臺、倒置顯微鏡、二氧化碳培養(yǎng)箱、水浴鍋、高壓滅菌鍋、離心機、濾器酒精燈、酒精棉、鑷子、器械缸、廢液缸、記號筆,蠟盤、大頭針、眼科剪、眼科鑷,移液器架、移液器、吸頭,試劑瓶、試劑瓶架,平皿、細胞培養(yǎng)瓶、離心管等試劑
PBS溶液
0.25%胰蛋白酶—0.02%EDTA溶液
DMEM培養(yǎng)基(含10%FBS及雙抗)實驗方法與步驟(一)將乳鼠(3天左右)斷頭放血致死。進入無菌間,用70%乙醇消毒乳鼠體表,將其固定在蠟盤上。在超凈臺內(nèi),將其背部皮膚剪出一個“工”字型開口,然后將皮膚拉開,固定在蠟盤上,使其腰背部肌肉暴露出來。實驗方法與步驟(二)用70%乙醇消毒背部肌肉,在脊柱兩側(cè)各剪一切口,取出腎臟,置于盛有PBS溶液的平皿中,除去腎膜與脂肪??v向?qū)⒛I臟剪開,除去腎盂。將腎臟剪成數(shù)塊,用PBS溶液再洗滌一次。吸去PBS溶液,將腎臟剪碎(小而均勻)。加入0.5mL胰酶—EDTA溶液,于37℃消化15~20分鐘,直至組織塊變白、呈疏松狀(鏡檢可見分散的細胞)加入0.5mL含血清DMEM培養(yǎng)基終止消化,反復(fù)“吹打”分散細胞去除大塊組織后,1000rpm離心10min;棄上清加入PBS溶液重復(fù)洗滌、離心一次加入1mL含血清DMEM細胞培養(yǎng)液重懸細胞;取少量細胞懸液(20uL),以PBS溶液稀釋后進行計數(shù)將細胞懸液按比例稀釋后,分裝至10mL培養(yǎng)瓶中(每瓶1.5mL,每瓶80~100萬細胞),37℃、5%CO2培養(yǎng)1~2日后,觀察細胞生長狀況,并更換部分或全部培養(yǎng)液細胞生長成單層后,即可進行傳代消化法消化結(jié)果將組織小塊(約1mm3)均勻擺放在培養(yǎng)瓶壁上,平均間隔0.5cm翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶,加入1mL含血清DMEM細胞培養(yǎng)液瓶口部稍向上傾斜,置于二氧化碳培養(yǎng)箱中(37℃、5%CO2)2hr后,將培養(yǎng)瓶輕輕翻轉(zhuǎn),繼續(xù)培養(yǎng)72hr后可以觀察到生長暈,繼續(xù)培養(yǎng)3~5日,更換部分或全部培養(yǎng)液待生長暈相連后,去掉組織塊,繼續(xù)培養(yǎng)3~4日,即可進行傳代培養(yǎng)組織塊法生長暈吸棄原培養(yǎng)基,以PBS溶液洗細胞1~2次;加入200uL消化液,37℃消化3min;加500uL含10%血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化;1000rpm,離心5min;加入1mL含血清DMEM細胞培養(yǎng)液重懸細胞;按比例分盤,37oC、5%CO2培養(yǎng);觀察記錄細胞生長狀況。腎細胞的傳代整理實驗前后,用酒精棉球?qū)⒊瑑襞_臺面擦干凈。取腎后,請及時將鼠尸體置于專門的垃圾袋中。蠟盤、大頭針用洗干凈后,浸泡于酒精中。小剪刀、小鑷子在超凈臺中,可放置在專用的器械缸中;用畢洗干凈,按規(guī)定放置(216,盆中)。消化用
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