未經(jīng)允許不得復(fù)印未經(jīng)允許不得復(fù)印未經(jīng)允許不得復(fù)印未經(jīng)允許不得復(fù)印■?“■?GenTarGet作業(yè)指導(dǎo)書深圳精準(zhǔn)醫(yī)療科技有限公司受控印章文件名稱文件編碼頁(yè)數(shù)第1頁(yè)共6頁(yè)起草人起草日期年月日頒發(fā)部門質(zhì)量管理部審核人審核日期年月日頒發(fā)日期年月日會(huì)簽人批準(zhǔn)人批準(zhǔn)日期年月日生效日期年月日分發(fā)部門研發(fā)部、市場(chǎng)部、質(zhì)量管理部CD19-CAR-T細(xì)胞制備工藝規(guī)程目的：制備符合規(guī)定、合格的CD19-CAR-T細(xì)胞范圍：職責(zé)：3.1技術(shù)人：負(fù)責(zé)按本工藝規(guī)程進(jìn)行細(xì)胞制備3.2實(shí)驗(yàn)室主管：負(fù)責(zé)本工藝規(guī)程的執(zhí)行。3.3質(zhì)量部：負(fù)責(zé)細(xì)胞制備全過(guò)程的監(jiān)督和管理。內(nèi)容：4.1產(chǎn)品名稱、劑型、規(guī)格：?產(chǎn)品名稱：CD19-CAR-T?產(chǎn)品劑型：?規(guī)格：100mL?性狀：液體?存儲(chǔ)條件及效期：?內(nèi)包裝：4.2產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)：詳見《XXX細(xì)胞質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》4.3儀器、設(shè)備一覽表:序號(hào)儀器設(shè)備性能要求序號(hào)儀器設(shè)備性能要求1潔凈工作臺(tái)/生物安全柜A級(jí)8條碼打印機(jī)

2二氧化碳培養(yǎng)箱9醫(yī)用40C冰箱3普通離心機(jī)10超低溫冰箱4掌上離心機(jī)11熱合機(jī)5倒置顯微鏡12水浴鍋6可調(diào)式移液器（移液槍）13細(xì)胞計(jì)數(shù)儀7電動(dòng)輔助移液器14*■*■??????GenTarGet作業(yè)指導(dǎo)書深圳精準(zhǔn)醫(yī)療科技有限公司文件編碼：第2頁(yè)共6頁(yè)受控印章GenTarGet受控印章作業(yè)指導(dǎo)書4.4試劑一覽表:序號(hào)試劑名稱規(guī)格1細(xì)胞培養(yǎng)基1L/瓶2細(xì)胞因子Alug/uL3細(xì)胞因子B106IU/mL4淋巴細(xì)胞分離液500mL/瓶6轉(zhuǎn)染增效劑8ug/mL7生理鹽水500mL/瓶8CD19-CAR-T慢病毒上清10mL/支4.5耗材一覽表:序號(hào)耗材規(guī)格1細(xì)胞培養(yǎng)板24孔板6孔板2細(xì)胞培養(yǎng)瓶T25T75

T1753培養(yǎng)袋2L/個(gè)4離心管15mL50mL250mL5移液管5mL10mL25mL6細(xì)胞濾網(wǎng)100目/個(gè)7輸液袋100mL8巴氏吸管3mL/5mL9EP管1.5mL*■*■??????GenTarGet作業(yè)指導(dǎo)書深圳精準(zhǔn)醫(yī)療科技有限公司文件編碼：第3頁(yè)共6頁(yè)受控印章GenTarGet受控印章作業(yè)指導(dǎo)書4.6試劑的配制：4.6.1培養(yǎng)基：將1支106IU的細(xì)胞因子B溶于1L培養(yǎng)基，配成完全培養(yǎng)基1。取4OmL完全培養(yǎng)基1,加入2uL細(xì)胞因子A,配成完全培養(yǎng)基2。4.7細(xì)胞制備工序要求：工序操作間潔凈級(jí)別設(shè)備名稱潔凈級(jí)別細(xì)胞制備制備室C級(jí)潔凈工作臺(tái)/生物安全柜A級(jí)細(xì)胞培養(yǎng)培養(yǎng)室C級(jí)CO2培養(yǎng)箱C級(jí)細(xì)胞收集制備室C級(jí)潔凈工作臺(tái)/生物安全柜A級(jí)4.8細(xì)胞制備流程圖

*■??■???????GenTarGet作業(yè)指導(dǎo)書深圳精準(zhǔn)醫(yī)療科技有限公司文件編碼：第4頁(yè)共6頁(yè)受控印章Day0Day0Day1Day0Day0Day1Day2?8細(xì)胞因子激活T細(xì)胞|細(xì)電因子A、B帶CD3■亠CAR的慢病毒上清轉(zhuǎn)染T細(xì)胞|專職剖-細(xì)血因子E

培養(yǎng)數(shù)天，擴(kuò)增基因修飾的T細(xì).亦Day10^12Day10^12IDay10^12Day10^124.9細(xì)胞制備:4.9.1第0天:第0天外周血交接1、技術(shù)貝檢查：A存放血液的容器是否兀好并密封；標(biāo)識(shí)是否清晰完整并正確；血液是否結(jié)塊，是否有溶血；血液量是否與標(biāo)識(shí)一致。2、檢查確認(rèn)合格后，填寫《標(biāo)本采集交接記錄》，雙人簽名確認(rèn)。3、接收外周血，并用75%酒精擦拭消毒2遍，移入制備區(qū)。制備前準(zhǔn)備1、淋巴細(xì)胞分離液和培養(yǎng)基恢復(fù)至室溫。2、準(zhǔn)備好若干50mL離心管和24孔培養(yǎng)板。單個(gè)核細(xì)胞的分離提取取出500uL全血置于干凈的1.5mLEP管中，用于血液二分類和流式檢測(cè)。將外周血用生理鹽水按1:1體積比稀釋。

加入15mL淋巴細(xì)胞分離液至50mL離心管管底，用25mL移液管將35mL血細(xì)胞小心緩慢鋪在淋巴細(xì)胞分離液上（電動(dòng)移液器吹液速度為零）。1800rpm,20min常溫離心，離心機(jī)升6降3。小心移去生理鹽水層，吸取白膜層至50mL離心管，補(bǔ)加生理鹽水至離心管滿體積，500g,5min常溫離心。倒去上清，加入生理鹽水，重懸細(xì)胞，常溫離心。洗2-3遍。用完全培養(yǎng)基2重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)。T細(xì)胞重懸和誘導(dǎo)活化1、按3X106個(gè)細(xì)胞/mL/well鋪在24孔板上。2、將24孔置于二氧化碳培養(yǎng)箱中（37°C,5%二氧化碳）培養(yǎng)。清場(chǎng)1、將被血液污染的耗材棄置在生物安全垃圾袋中。2、完全培養(yǎng)基1和2配制完后4度保存。注意事項(xiàng)1、*■*■??????GenTarGet作業(yè)指導(dǎo)書深圳精準(zhǔn)醫(yī)療科技有限公司文件編碼：第5頁(yè)共6頁(yè)受控印章GenTarGet受控印章作業(yè)指導(dǎo)書4.9.2第1天（細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)）:第1天帶CD19-CAR慢病毒上清轉(zhuǎn)染T細(xì)胞1、將24孔板的細(xì)胞收集，用生理鹽水洗滌兩次，500g,5min常溫離心。2、用帶CD19-CAR慢病毒上清重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)，并用病毒上清稀釋至終濃度3X106個(gè)細(xì)胞/mL，加入總體積千分之一體積的轉(zhuǎn)染增效劑。3、1000g，離心，2h。4、在二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)8小時(shí)后每個(gè)24孔板的孔補(bǔ)加500uL完全培養(yǎng)基1。注意事項(xiàng)1、4.9.3第3天（轉(zhuǎn)瓶、補(bǔ)液）第3天轉(zhuǎn)瓶、補(bǔ)液1、將24孔板的細(xì)胞轉(zhuǎn)入T75的細(xì)胞培養(yǎng)瓶，并補(bǔ)充等倍體積的完全培養(yǎng)基1進(jìn)T75的細(xì)胞培養(yǎng)瓶。注意事項(xiàng)1、

*■??????GenTarGet作業(yè)指導(dǎo)書深圳精準(zhǔn)醫(yī)療科技有限公司文件編碼：第6頁(yè)共6頁(yè)受控印章4.9.4第5天（轉(zhuǎn)袋、補(bǔ)液）:第5天CD19-CAR-T細(xì)胞轉(zhuǎn)袋補(bǔ)液11、補(bǔ)充完全培養(yǎng)基1至400mL后，轉(zhuǎn)入2L的培養(yǎng)袋中繼續(xù)培養(yǎng)。注意事項(xiàng)1、轉(zhuǎn)袋后間隔1天攤開手掌輕壓一下培養(yǎng)袋，以推散細(xì)胞聚集。注意事項(xiàng)操作完，及時(shí)清場(chǎng)，并做好相關(guān)記錄以及細(xì)胞制備檔案填寫。清場(chǎng)1、4.9.5第10天（收獲細(xì)胞）第10天收獲細(xì)胞1、將2L培養(yǎng)袋的細(xì)胞培養(yǎng)液分裝至225mL的離心管中，500g,5min。2、將細(xì)胞用生理鹽水洗兩次，并用100mL生理鹽水重懸。3、將細(xì)胞懸液過(guò)細(xì)胞濾網(wǎng)后，進(jìn)袋，密