阪崎腸桿菌檢驗

GB4789.40-2010張秀麗河南省疾病預(yù)防控制中心當(dāng)前第1頁\共有36頁\編于星期三\12點Enterobactersakazakii(ES)2當(dāng)前第2頁\共有36頁\編于星期三\12點內(nèi)容第一部分：一般特征第二部分：致病性第三部分：ES的檢驗3當(dāng)前第3頁\共有36頁\編于星期三\12點第一部分：一般特征培養(yǎng)特征生化反應(yīng)抵抗力增殖能力與其他常見腸桿菌相似4當(dāng)前第4頁\共有36頁\編于星期三\12點一、培養(yǎng)特征

ES在VRBGA平板上首次劃線分離時，37℃培養(yǎng)24h可生成2種不同的形態(tài)學(xué)特征：干燥或粘液狀、圓鋸齒狀（凹口或鋸齒），用金屬環(huán)接觸時可發(fā)現(xiàn)堅韌或有彈力，即粘貼金屬環(huán)的菌量很少，并且菌落可很快恢復(fù)。傳代培養(yǎng)后可能會轉(zhuǎn)變?yōu)榈湫偷墓饣?。光滑、易于用金屬環(huán)從菌落移取細胞。 ___國外文獻報道5當(dāng)前第5頁\共有36頁\編于星期三\12點本實驗室大多數(shù)分離株呈流蠟樣，粉紫色、圓形、光滑、凸起、飽滿，并散發(fā)出特殊氣味；干燥、頂端發(fā)白的粉紫色菌落；從配方粉中初次分離到的該菌在VRBGA平板上過夜培養(yǎng)后呈現(xiàn)特殊的菌落形態(tài)：菌落干燥、邊緣有褶皺，極富彈性。傳代后，菌落皺褶減少，延長培養(yǎng)時間，可見皺褶逐漸增加。6當(dāng)前第6頁\共有36頁\編于星期三\12點二、生化反應(yīng)

特征性生化反應(yīng)結(jié)果D-山梨醇-產(chǎn)生吐溫80脂酶+細胞外Dnase+氧化酶試驗-黃色菌落+α-葡萄糖苷酶+7當(dāng)前第7頁\共有36頁\編于星期三\12點ES及親緣關(guān)系較近的腸桿菌生化反應(yīng)比較試驗生化反應(yīng)1阪崎腸桿菌陰溝腸桿菌產(chǎn)氣腸桿菌成團腸桿菌日勾維腸桿菌賴氨酸脫羧酶－－＋－＋精氨酸雙水解酶＋＋－－－鳥氨酸脫羧酶＋＋＋－＋KCN生長＋＋＋v＋發(fā)酵:蔗糖＋＋＋(＋)＋衛(wèi)矛醇－(－)－(－)－核糖醇－(－)＋－－棉子糖＋＋＋v＋D-山梨醇－＋＋v－χ-甲基-葡萄糖甙＋(＋)－－－D-阿拉伯糖醇－(－)＋－＋黃色素＋－－(＋)－注：＋：90-100％；(＋)：75-89%；V：25-74％；(－)：10-24％；－：0-9％8當(dāng)前第8頁\共有36頁\編于星期三\12點三、抵抗力耐熱性滲透壓干燥不同菌株的耐熱性存在明顯的差別，但標準的巴氏消毒過程能有效的滅活ES。ES對滲透壓的耐受性使該菌能夠成為環(huán)境中的優(yōu)勢株，增加PIF加工后污染的危險性，使其在PIF中長期存活。9當(dāng)前第9頁\共有36頁\編于星期三\12點四、增殖能力6℃，21℃，37℃分別是13.7h，1.7h，19－21min。MRA發(fā)現(xiàn)，與本底相比，25℃放置6h該菌的相對危險性可增加30倍；25℃放置10h可增加30000倍。2004年2月FAO/WHO在日內(nèi)瓦召開的PIF中ES專家研討會上提出PIF中微量的ES（＜3CFU/100g）污染也能導(dǎo)致感染的發(fā)生。10當(dāng)前第10頁\共有36頁\編于星期三\12點第二部分：致病性易感人群主要感染渠道配方粉中ES的污染狀況PIF中ES的來源及中毒發(fā)生的原因11當(dāng)前第11頁\共有36頁\編于星期三\12點一、易感人群嬰兒：腦膜炎壞死性小腸結(jié)腸炎菌血癥嚴重的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥高危人群：主要是嬰兒，新生兒、尤其是早產(chǎn)兒、低出生體重等免疫力低下的嬰兒。死亡率：50%，20-50%成人：局部感染、菌血癥、術(shù)后骨髓炎等12當(dāng)前第12頁\共有36頁\編于星期三\12點二、主要感染渠道?。?！乳品安全標準（報批稿）《嬰兒配方食品》《特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品》0-6個月齡13當(dāng)前第13頁\共有36頁\編于星期三\12點三、配方粉中ES的污染狀況研究樣品腸桿菌（+）ES（+）菌種（%）Muytjens等1980141（MPN/100g）75（51.8%）20（14.2%）E.agglomerans(24.8)E.cloacae(21.3)E.sakazakii(14.2)Iversen和Forsythe200482（25g）7（8.5%）2（2.4%）Pantoeaspp（2.4)E.cloacae(1.2)E.sakazakii(2.4)本試驗室2006212（40g）103（48.58%）11（5.19%）Pantoeaspp（11.32）E.cloacae（7.55）E.sakazakii（5.19）產(chǎn)品召回食品、環(huán)境廣泛分布14當(dāng)前第14頁\共有36頁\編于星期三\12點四、PIF中ES的來源及中毒發(fā)生的原因目前公共衛(wèi)生關(guān)注的PIF中ES的來源包括以下2種情況：內(nèi)在污染——二次污染。

如：加工環(huán)境中微生物的存在；加工裝置內(nèi)表面微生物的存在；熱處理后，與干燥基粉混合的加入成分中存在的微生物。外源性污染——配方粉調(diào)制環(huán)境和調(diào)制器皿。受ES污染的配方粉或調(diào)制配方在較高溫度下存放，食用前不加熱，或加熱不徹底，喂食時間較長等都可導(dǎo)致ES有機會生長繁殖，增加患病的危險性。15當(dāng)前第15頁\共有36頁\編于星期三\12點

PIF中ES的安全性問題，已成為全球關(guān)注的焦點。2002年ICMSF把ES列為“嚴重危害特殊人群，威脅生命、導(dǎo)致慢性實質(zhì)性后遺癥或長期影響”的一種病原菌。2004年2月FAO/WHO在日內(nèi)瓦召開的PIF中ES專家研討會：ES列為PIF中僅有的兩種A類致病菌（沙門和阪崎）之一。16當(dāng)前第16頁\共有36頁\編于星期三\12點第三部分

食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗阪崎腸桿菌檢驗當(dāng)前第17頁\共有36頁\編于星期三\12點本標準修改采用ISO/TS22964（1stedition2006-02-01）Milkandmilkproducts—DetectionofEnterobactersakazakiiFDAJuly2002;RevisedAugust2002IsolationandEnumerationofEnterobactersakazakiifromDehydratedPowderedInfantFormula18當(dāng)前第18頁\共有36頁\編于星期三\12點第一法：阪崎腸桿菌的檢驗

第二法：阪崎腸桿菌的計數(shù)

19當(dāng)前第19頁\共有36頁\編于星期三\12點第一法

阪崎腸桿菌的檢驗20當(dāng)前第20頁\共有36頁\編于星期三\12點阪崎腸桿菌檢驗程序報告生化鑒定挑取黃色菌落DFI瓊脂36℃±1℃，24h±2h挑取藍綠色菌落1mL+mLST-Vm10mL44℃±0.5℃，24h±2h檢樣100g/mL+稀釋液900mL36℃±1℃，18h±2h前增菌選擇性增菌選擇性分離生化鑒定TSA25℃±1℃，48h±4h當(dāng)前第21頁\共有36頁\編于星期三\12點5.1前增菌和增菌BPW（合適時可選擇無菌水）左圖：未混合；右圖：混合后。22當(dāng)前第22頁\共有36頁\編于星期三\12點mLST-VmmLST-Vm，即在大腸菌群增菌肉湯LST中另加入適量的NaCl和Vm。研究證明與其他腸桿菌科細菌（如沙門菌屬、大腸埃希氏菌等）相比，ES具有較高的耐滲透壓能力。加入0.5M的NaCl在保證ES良好生長的同時，可以有效地抑制上述其他細菌的生長。Vm可有效地抑制G+菌的生長。而較高的生長溫度可以進一步抑制其他細菌的生長。23當(dāng)前第23頁\共有36頁\編于星期三\12點5.2分離顯色培養(yǎng)基的基本原理相似，二者都是根據(jù)ES能產(chǎn)生α-葡萄糖苷酶，分解底物XaGlc產(chǎn)生有色菌落。24當(dāng)前第24頁\共有36頁\編于星期三\12點顯色培養(yǎng)基對ES的選擇性較好，ES形成的特征性菌落易于辨認，以DFI為例：硫化氫指示劑可以區(qū)分ES和產(chǎn)生少量α-葡萄糖苷酶但H2S陽性菌株（如普通變形桿菌）。ES都可以在該平板上生長并產(chǎn)生藍綠色菌落其他常見菌在DFI平板的菌落顏色白色菌落：肺炎克雷伯氏菌、陰溝腸桿菌、大腸埃希氏菌、泛菌屬的多種菌等黃色菌落：赫氏埃希氏菌黑褐色、粉色或中心藍綠菌落：少量菌種ESIA:藍色，1-3mm國產(chǎn)顯色培養(yǎng)基25當(dāng)前第25頁\共有36頁\編于星期三\12點36℃±1℃24h±2h26當(dāng)前第26頁\共有36頁\編于星期三\12點黃色素TSA：25℃培養(yǎng)后典型ES：黃色陰性對照E.coliATCC25922：白色菌落27當(dāng)前第27頁\共有36頁\編于星期三\12點5.3鑒定（生化反應(yīng)）生化試驗特征黃色素產(chǎn)生＋氧化酶－L-賴氨酸脫羧酶－L-鳥氨酸脫羧酶（＋）L-精氨酸雙水解酶＋檸檬酸水解(＋)發(fā)酵：D-山梨醇（－）L-鼠李糖＋D-蔗糖＋D-蜜二糖＋苦杏仁甙＋注：＋＞99%陽性；－＞99%陰性；（＋）90%－99%陽性；（－）90%-99%陰性。28當(dāng)前第28頁\共有36頁\編于星期三\12點商業(yè)生化鑒定系統(tǒng)的應(yīng)用推薦使用的ES生化鑒定方法有很多，主要有API20E，ID32E，BiologGN2MicroPlate，VITEKGNI+等。上述方法都比較成熟，穩(wěn)定性較好，已被許多國家和組織的標準采用。在腸桿菌的生化鑒定中使用最廣泛的是API20E和VitekGNI+。29當(dāng)前第29頁\共有36頁\編于星期三\12點API20E生化鑒定板典型生化反應(yīng)圖示API20E反應(yīng)編碼API20E結(jié)果評價3345373Excellentidentification3305173Excellentidentification3305363Verygoodidentification3305373GoodidentificationAcceptableidentification？VITEK30當(dāng)前第30頁\共有36頁\編于星期三\12點質(zhì)量控制選擇近期分離的阪崎腸桿菌陽性菌株或標準菌株作為陽性對照，檢測增菌液和分離培養(yǎng)基對阪崎腸桿菌生長的影響和生化鑒定結(jié)果，對整個實驗的操作過程進行質(zhì)量控制。31當(dāng)前第31頁\共有36頁\編于星期三\12點阪崎腸桿菌檢測方法的比較2005年從10個?。ㄊ校┑牧闶刍蚺l(fā)市場采集的194份配方粉。FDA定性檢測檢出4個陽性樣本，本定性檢測檢出5個，其中4個在第一法的檢測中均為陽性，另一陽性檢出樣品在第一法中的檢測結(jié)果為陰性。*“粉紫色、圓形、光滑、凸起、飽滿”。選擇性分離平板上分離株的菌落特征和樣品數(shù)量VRBGADFI菌落特征樣品數(shù)量

菌落特征樣品數(shù)量無任何菌落生長14無任何菌落生長163直徑<1mm的菌落1371種藍綠色菌落52種菌落61種白色菌落22典型菌落*5（3）白色菌落和藍綠色菌落各1種31種非典型菌落32（1）1種白色菌落但略顯淡綠1合計194

合計19432當(dāng)前第32頁\共有36頁\編于星期三\12點第二法

阪崎腸桿菌的計數(shù)33