生物大分子分離純化——原理與技術當前第1頁\共有115頁\編于星期四\19點內容提要1、層析原理與技術2、凝膠過濾層析3、UNOsphere離子交換分離技術4、CHT陶瓷羥基磷灰石分離技術5、疏水相互作用與親和層析當前第2頁\共有115頁\編于星期四\19點Lifeisbasedonproteinsandtheirinteractions當前第3頁\共有115頁\編于星期四\19點層析原理與操作當前第4頁\共有115頁\編于星期四\19點

層析的起源和原理起源----1906年，俄國植物學家Tsweet原理----利用物質分配系數(shù)不同達到分離目的原理與操作Chromatography層析色譜當前第5頁\共有115頁\編于星期四\19點什么是生物層析

根據(jù)生物分子物理化學特性的不同而達到分離極性：polarity(solubility,volatility)HIC,RP

離子特性：ioniccharacteristics(charge)IEX

大小與形狀：size/mass(diffusion,sedimentation)GF

結構特征與活性位點：shape(ligandbinding,affinity)AC

這些特性的區(qū)別使不同蛋白質分子在層析的固定相和流動相的分配不同而達到分離原理與操作當前第6頁\共有115頁\編于星期四\19點GelFiltration凝膠過濾IonExchange離子交換HydrophobicInteraction疏水層析反相Affinity親和層析CHT羥基磷灰石原理與操作當前第7頁\共有115頁\編于星期四\19點

最廣泛的蛋白質分離純化方法

條件溫和維持蛋白質空間結構與活性

基于蛋白質對固定相的不同保留達到分離蛋白質溶于流動相中，經過裝填固定相的柱子分離層析原理與操作當前第8頁\共有115頁\編于星期四\19點層析的5個操作步驟裝柱并平衡上樣平衡洗脫再生上樣裝填有層析介質的層析柱分離分離組分流出原理與操作當前第9頁\共有115頁\編于星期四\19點層析圖原理與操作第一峰,外水體積,Vo,不與柱中填料相互作用直接從柱中流出。這是樣品中的未結合物質VoVeVt蛋白質含量(A280),由UV檢測器讀出，y軸基線洗脫峰，有些可以很好的分離，有些分得不是很好，有部分交叉有時這里也顯示梯度濃度等檢測值時間或體積，x軸當前第10頁\共有115頁\編于星期四\19點純化平臺的硬件結構——

層析工作站層析介質和層析柱原理與操作當前第11頁\共有115頁\編于星期四\19點層析系統(tǒng)DuoFlow中高壓層析系統(tǒng)LP低壓層析系統(tǒng)Profinia全自動親和層析系統(tǒng)手動層析組件當前第12頁\共有115頁\編于星期四\19點DuoFlow中高壓層析系統(tǒng)主要特點：3500psi高壓力下梯度模式最大流速可達20ml/min連續(xù)波長，4波長同步檢測方形X、Y軸組分收集器軟件直觀容易使用當前第13頁\共有115頁\編于星期四\19點BioLogicLP低壓層析系統(tǒng)LPDataView軟件BioLogicLP系統(tǒng)BioFrac方形組分收集器主要特點：流速精確，0.01ml/min檢測靈敏度更高,0.001AU兼容方形收集器當前第14頁\共有115頁\編于星期四\19點Profinia蛋白質純化系統(tǒng)主要特點：全自動親和純化，包括親和標簽、親和無標簽，抗體等純化雙紫外檢測器設計純化與脫鹽串聯(lián)一步完成結果直接報告目標蛋白的濃度和得率當前第15頁\共有115頁\編于星期四\19點為什么在層析技術中要使用層析儀介質的要求實驗的精密度和重現(xiàn)性要求時間的要求當前第16頁\共有115頁\編于星期四\19點純化平臺的硬件結構——

層析介質與層析柱，原理與技術當前第17頁\共有115頁\編于星期四\19點層析介質離子交換層析介質

UnosphereQ，SMacroPrepHighQ,HighS,DEAE,CM親和層析

ProfinityIMAC金屬螯合介質

ProfinityEpoxide環(huán)氧親和介質

Affi-GelProteinA,Affi-PrepProteinAAffi-Gel藍膠，DEAE藍膠，CM藍膠

Affi-Prep多粘菌素介質

Affi-Gel硼膠

Affi-Gel配體固定化活化介質凝膠過濾層析介質

Bio-GelP系列

Bio-BeadsS-X介質羥基磷灰石介質（CHT）氟代羥基磷灰石介質（CFT）疏水層析介質

Macro-PrepMethylHICMacro-Prept-ButylHICBio-BeadsSM-2吸附劑當前第18頁\共有115頁\編于星期四\19點層析柱分析柱離子交換分析柱：UnoQ,SAminex分析柱——分析單糖、寡糖、有機酸、有機堿，以及肽和核酸有機小分子羥基磷灰石分析柱：Bio-ScaleCHT-I

凝膠過濾分析柱：Bio-Sil,Bio-SilectHPLC分析柱反相層析分析柱：Hi-PoreRP304,Hi-PoreRP318各種層析介質的Cartridges——用于條件摸索

UNOsphereMacroPrepCHTHIC當前第19頁\共有115頁\編于星期四\19點層析介質結構原理UnosphereMacroPrep離子交換層析Q，S，DEAE，CM疏水層析-CH3,t-Butyl親和層析ProteinAIDA－Ni多粘菌素凝膠過濾CHT和CFTUnosphereQ,SMacroPrepHighQ,SMacroPrepDEAE,CMMacroPrepMethylHICMacroPrept-ButylHICProfinityIMACProfinityEpoxideAffi-GelProteinA,Affi-PrepProteinAAffi-Gel,DEAE,CMAffi-PrepPolymixinAffi-Gel硼膠Affi-Gel配體固定化活化當前第20頁\共有115頁\編于星期四\19點層析介質及其技術凝膠過濾層析離子交換層析羥基磷灰石層析疏水層析親和層析當前第21頁\共有115頁\編于星期四\19點1.Sphericalparticlespackedintoacolumn2.Sampleapplied3. Buffermobilephaseandsamplemovethroughcolumn,moleculesdiffuseinandoutofmatrix4.largemoleculesleavethecolumnfirstfollowedbysmallermoleculesinorder

ofsize,moleculeslargerthanthematrixporespassstraightthrough.DiffusionBufferDiffusionintotheporesDiffusionoutoftheporesBuffer凝膠過濾當前第22頁\共有115頁\編于星期四\19點凝膠過濾層析分離純化原理當前第23頁\共有115頁\編于星期四\19點Agoodgelforgelfiltrationcontainsabout95%water凝膠結構當前第24頁\共有115頁\編于星期四\19點Stericexclusionleadstoearlyelution按照分子量大小洗脫大分子首先洗脫，最小的分子在最后面洗脫當前第25頁\共有115頁\編于星期四\19點1001,00010,000100,000Bio-GelP2Bio-GelP4Bio-GelP6Bio-GelP10Bio-GelP30Bio-GelP60Bio-GelP1001,8008004,0001,0006,000，用于脫鹽1,50020,0002,50040,0003,00060,0005,000100,000100凝膠過濾層析凝膠的選擇當前第26頁\共有115頁\編于星期四\19點Bio-GelP4(800-4,000)forseparationdigestedproductsfromIgG凝膠過濾層析凝膠的選擇當前第27頁\共有115頁\編于星期四\19點凝膠過濾層析Bio-GelP6(1000-6000)凝膠的選擇當前第28頁\共有115頁\編于星期四\19點凝膠過濾層析Bio-GelP10(1500-20,000)凝膠的選擇當前第29頁\共有115頁\編于星期四\19點凝膠過濾層析Bio-ScaleMiniBio-GelP6脫鹽預裝柱操作方便，可連接在DuoFlow、LP、Profinia和Econo泵上當前第30頁\共有115頁\編于星期四\19點Bio-BeadsS-X介質——

多孔的聚苯乙烯二乙烯微球體Bio-BeadsS-X1Bio-BeadsS-X3600Bio-Beads

S-X81,000Bio-Beads

S-X12400高分辨率親脂性分子排阻色譜2,00014,000中草藥和天然產物活性成分分離純化高分辨率，快速純化酯類、芳香族，多環(huán)、雜環(huán)化合物介質可兼容苯、甲苯、二甲苯、四氯化碳、二甲基甲酰胺、酮、二氯甲烷、二氯代苯、全氯乙烯等有機溶劑凝膠過濾層析當前第31頁\共有115頁\編于星期四\19點1、三硬脂酸甘油酯，8912、三肉豆蔻酸甘油酯，7293、三月桂酸甘油酯，6454、三辛酸甘油酯，4775、三己酸甘油酯，3936、十六烷，2267、十一烷，156Bio-BeadsS-X8分離效果高分辨率親脂性分子排阻色譜——Bio-BeadsS-X介質凝膠過濾層析當前第32頁\共有115頁\編于星期四\19點柱長的選擇

分離：30－120cm

脫鹽：30cm以下

洗脫液

離子強度低高離子作用排阻作用（0.1-0.5M)疏水作用pH——中性流速，根據(jù)層析介質的說明，一般很低樣品容量：1－3％CV凝膠過濾層析操作參數(shù)選擇當前第33頁\共有115頁\編于星期四\19點增加分辨率的方法檢測柱效檢測分離度減少上樣體積降低流速使用更小的介質顆粒的介質連接2根層析柱當前第34頁\共有115頁\編于星期四\19點1.可分離相對分子量從幾百到幾十萬的物質

具有3000個理論塔板的凝膠過濾可將分子量相差2倍的蛋白質完全分開,6000個理論塔板的可將分子量相差1.5倍的蛋白質完全分開;建議柱高在80-120cm,直徑=H/302.脫鹽凝膠過濾層析凝膠過濾層析的應用當前第35頁\共有115頁\編于星期四\19點凝膠過濾層析凝膠過濾層析的特點：層析柱規(guī)模很大，實驗室1.0-2.5×30-100cm，工藝10－20×200cm，從而設備成本很高；上樣體積少，必須少于柱床體積的3％才能達到較好的分離效果，如果大體積樣品必須濃縮，從而造成樣品的損失和增大工藝的復雜性；工藝時間（生產周期）長，甚至24小時或以上；分辨率低；不需摸索純化條件，按照分子量區(qū)帶分離因此，往往用分子篩分離時只適用于純化的最后一步去熱原，或離子交換上樣前的脫鹽當前第36頁\共有115頁\編于星期四\19點cationweakstronganionweakstrongDEAEDiethylamino-ethylQQuaternaryamineCMCarboxy-methylSSulfonate離子交換層析離子交換層析類型及其選擇-O-CH2CH2-NH+C2H5C2H5-N+(CH3)3-O-CH2-C-O-O-SO3-當前第37頁\共有115頁\編于星期四\19點pIstabilityrangestabilityrange與陽離子交換介質結合+-denaturationdenaturationpH102離子交換層析離子交換層析原理——蛋白質滴定曲線蛋白質凈電荷與陰離子交換介質結合當前第38頁\共有115頁\編于星期四\19點Products:UNOsphere?Q&S,Macro-Prep?HighQ&S,CM,DEAE,AG?resinsEquilibrationSampleApplicationSampleAdsorptionElutionRegeneration--++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++-----++++++++++++++++++++++++++++++------------++++++++++++++++++++++++++++++離子交換層析離子交換層析原理當前第39頁\共有115頁\編于星期四\19點sampleapplicationandwashelutionequilibrationregeneration--------------------------------------------------------------------++++++++++++++++++++++++++++++-----------anionexchangerbead離子交換過程當前第40頁\共有115頁\編于星期四\19點離子強度洗脫時多采用離子濃度梯度,常加NaCl,KCl,LiCl等.

在不同鹽濃度（離子強度）及其不同變化率（梯度）條件下保留行為不同，需對該條件進行摸索。一般的，隨離子強度增加，蛋白質保留值減小。緩沖液與pH

選擇適當?shù)木彌_體系，起始濃度要盡可能低些(0.01-0.05M)

緩沖液PH值：陽離子低于pI一個pH單位以上陰離子通常高于pI一個pH單位以上

蛋白質在不同pH下保留行為差別較大，所以許對緩沖體系和操作pH進行摸索，以得到最佳層析條件。離子交換層析離子交換層析操作參數(shù)選擇當前第41頁\共有115頁\編于星期四\19點pI＝5.5+-pH102離子交換層析緩沖液與pHpI＝7.5陽離子交換陰離子交換堿性蛋白，采用陽離子交換酸性蛋白，采用陰離子交換蛋白質凈電荷pH4.0pH9.0蛋白質穩(wěn)定性范圍當前第42頁\共有115頁\編于星期四\19點pH7.0pH8.0pH8.9pH6.0pH6.0pH7.0pH8.0pH8.9緩沖液與pH的影響——陰離子交換離子交換層析離子交換層析操作參數(shù)選擇當前第43頁\共有115頁\編于星期四\19點離子交換層析離子交換層析操作參數(shù)選擇鹽溶液梯度的影響當前第44頁\共有115頁\編于星期四\19點Columns

MediaBio-ScaleMiniHighQMacro-PrephighQBio-ScaleMiniHighDEAEMacro-PrepDEAEBio-ScaleMiniHighS Macro-PrephighSBio-ScaleMiniUNOsphereQ Macro-PrepCMBio-ScaleMiniUNOsphereS Macro-Prep25QBio-ScaleMiniUNOsphererapidSMacro-Prep25SUNOQ UNOsphereQUNOS UNOsphereSUNOsphererapidS離子交換層析離子交換層析產品50um25um120um80um10um100um當前第45頁\共有115頁\編于星期四\19點更高的選擇性和分辨率10%穿透載量:UnosphereQ:>150mg/mlBSA@600cm/hrUnosphereS:>30mg/mlBIgG@600cm/hr高流速，低反壓

－操作壓力:<2bar@1200cm/hrwith20cm更高的堿穩(wěn)定性短期:1.0MNaOH@RTfor>1week長期:Storagein0.1MNaOH@RTfor>1year生產效率大大提高離子交換層析UNOsphereQ/S性能參數(shù)當前第46頁\共有115頁\編于星期四\19點Column1.1x20cmLoadbuffer:20mMTris,pH8.5ElutionBuffer:Load+0.5NaClLoad:5mg/mlBSAColumn1.1x20cmLoadbuffer:20mMNaAc,pH5.0ElutionBuffer:Load+0.5NaClLoad:1.64mg/mlhIgGUNOsphereQ:BSAUNOsphereS:HIgG高流速，高載量：Unosphere當前第47頁\共有115頁\編于星期四\19點高流速，低反壓：Unosphere當前第48頁\共有115頁\編于星期四\19點SupportLinearvelocity(cm/hr)Recovery(%)BSAbindingcapacity(g/L)Processtime(hr)Productivity(g/L/hr)UNOsphereQ6151001201.5875.0QSepharoseFF30099.023.01.1919.0FractogelEMDTMAE(M)10599.082.05.0416.0SupportLinearvelocity(cm/hr)Recovery(%)HumanIgGbindingcapacity(g/L)Processtime(hr)Productivity(g/L/hr)UNOsphereS110098.632.00.6053.3SPSepharoseFF50097.814.30.7718.5FractogelEMDSO3(M)23197.066.46.5010.2離子交換層析當前第49頁\共有115頁\編于星期四\19點UNOsphere更高的生產效率：更短的工藝時間短時間內處理大量體積樣品更小的層析柱，更少的介質更高的產量更短的生產周期生產成本下降離子交換層析蛋白質純化，特別是從原材料或發(fā)酵中間體目標蛋白的大量捕獲中間純化UNOsphereQ/S應用當前第50頁\共有115頁\編于星期四\19點4ProcessSteps 1.Polymerization 2.Washing 3.Deagg/Sizing 4.BaseTreatmentMonomerCross-linkerIonomerSurfactantSaltSolventInitiatorHeatBaseTreatmentBottlingIPAWashUnsizedUNOsphereBeadWetSizingSizedUNOsphereBeadDeaggUNOsphere制造過程當前第51頁\共有115頁\編于星期四\19點UNOsphere%cross-linker: S 25% Q 25%離子交換層析UNOsphereQ/S結構當前第52頁\共有115頁\編于星期四\19點Continuousnetworkofpolymernodules0.5-1μmChannels3-5μm

Q：－(CH3)3N+S：－SO3-ProfinityIMAC：－IDA-Ni，Cu，Co離子交換層析UNOsphereQ/S結構當前第53頁\共有115頁\編于星期四\19點Reference:T.Ogawaet.al.HydroxyapatiteConference2001陶瓷羥基磷灰石（CHT）分離技術合成當前第54頁\共有115頁\編于星期四\19點左邊:Bio-GelHT/HTP羥基磷灰石右邊:CFT/CHTTM

陶瓷羥基磷灰石I&II晶體與陶瓷結構陶瓷羥基磷灰石（CHT）分離技術當前第55頁\共有115頁\編于星期四\19點Ca10(PO4)6(OH)25個帶正電荷的Ca離子對（C位點）2個磷酸三價離子，每個含有帶6個負電荷的氧原子（P位點）2個羥基于其他層析介質不同，CHT的骨架是化學反應的表面CHT陶瓷羥基磷灰石晶體結構陶瓷羥基磷灰石（CHT）分離技術當前第56頁\共有115頁\編于星期四\19點產品類型與參數(shù)陶瓷羥基磷灰石（CHT）分離技術當前第57頁\共有115頁\編于星期四\19點蛋白質帶正電氨基經典的陽離子交換用中性鹽溶液(NaCl)或緩沖鹽溶液(PO4)洗脫初級保留機制陶瓷羥基磷灰石（CHT）分離技術當前第58頁\共有115頁\編于星期四\19點帶負電羧基經典的金屬螯合作用，并受離子排阻調節(jié)比離子間靜電相互作用強15–60倍在無PO4條件下不能被任何濃度NaCl洗脫用PO4洗脫初級保留機制陶瓷羥基磷灰石（CHT）分離技術當前第59頁\共有115頁\編于星期四\19點大部分大分子蛋白質以兩種保留機制聯(lián)合模式結合：Ca親和與陽離子交換酸性蛋白質的結合，如白蛋白（albumin）以鈣親和作用為主，陽離子交換僅有輕微的作用，這意味著NaCl對白蛋白載量和保留的影響是非常有限的。堿性蛋白質，如IgG以陽離子交換作用為主，其載量和保留受NaCl影響顯著注：對于帶負電荷的酸性蛋白質，無論樣品是否含有NaCl，都對上樣時的吸附載量和保留無影響，這意味著可以將捕獲階段獲得的中間體樣品無需脫鹽處理即可上樣到CHT上進行高分辨率中間純化混合保留機制陶瓷羥基磷灰石（CHT）分離技術當前第60頁\共有115頁\編于星期四\19點Equlibrate:5mMNaPO4pH6.5Gradient:5mM–300mMNaPO4Eq:5mMPO4,0.3MNaClpH6.5Grad:5mM–300mMPO4,0.3MNaClIgGMAbBSA混合保留機制陶瓷羥基磷灰石（CHT）分離技術當前第61頁\共有115頁\編于星期四\19點單克隆抗體，多克隆抗體純化重組疫苗抗體片段重組蛋白質酶核酸:DNA/RNA(單雙鏈)膜蛋白質羥基磷灰石應用陶瓷羥基磷灰石（CHT）分離技術當前第62頁\共有115頁\編于星期四\19點優(yōu)點獨特的分離機制高再生能力高分辨率容易規(guī)模放大容易進行方法開發(fā)高機械穩(wěn)定性高化學穩(wěn)定性層析柱壽命長易于將HT工藝直接轉移到CHT/CFT上CFT比CHT更耐酸顆粒大?。?0um、40um和80um陶瓷羥基磷灰石（CHT）分離技術當前第63頁\共有115頁\編于星期四\19點TypeI由于具有更高的表面積，I型具有更高的蛋白載量，而且具有更大的保留.TypeII由于具有大孔結構，II型具有更高的核酸載量，能分離單鏈和雙鏈DNA，和超螺旋與非超螺旋的DNA白蛋白不能與II型結合，對于一些含白蛋白的抗體樣品，II型分離純化更有利.大分子重組疫苗的中間純化和大規(guī)模制備如何選擇類型陶瓷羥基磷灰石（CHT）分離技術當前第64頁\共有115頁\編于星期四\19點CHT純化或去除DNA的機理陶瓷羥基磷灰石（CHT）分離技術當前第65頁\共有115頁\編于星期四\19點分離純化原理與操作參數(shù)選擇羥基磷灰石（CHT）影響蛋白質色譜行為的操作參數(shù)：

CHT類型

NaCl濃度

PB緩沖液濃度梯度雙梯度洗脫

PB緩沖液梯度含不同NaCl濃度緩沖液pH值雙梯度洗脫模型先以0-500mMNaCl，再以0-500mM磷酸鉀當前第66頁\共有115頁\編于星期四\19點不同類型CHT陶瓷羥基磷灰石在不同pH下不同蛋白質的保留時間（min）羥基磷灰石（CHT）當前第67頁\共有115頁\編于星期四\19點不同蛋白質分離純化的Protocol：IgG羥基磷灰石（CHT）當前第68頁\共有115頁\編于星期四\19點不同蛋白質分離純化的Protocol：球形蛋白質，質粒羥基磷灰石（CHT）當前第69頁\共有115頁\編于星期四\19點不同蛋白質分離純化的Protocol：酸性蛋白質羥基磷灰石（CHT）當前第70頁\共有115頁\編于星期四\19點雙梯度洗脫羥基磷灰石（CHT）0-0.5MNaCl0-0.4MNaPO4玉米種子中純化轉基因抗體IgG當前第71頁\共有115頁\編于星期四\19點圖1CHT-I柱純化α1-AT。柱尺寸：7×52mm(10ml)；上樣量：5.0ml；BufferA：10mM磷酸鈉緩沖液（pH7.0）；BufferB：400mM磷酸鈉緩沖液（pH7.0）；梯度：0-5%B和5-30%B各5個柱體積，30-100%B10個柱體積；流速：2.5ml/min。分部收集組分為1.5ml，收集如下：收集組分I-VIII分別為：運行組分（圖上方軸）12-17、23-24、42-49、49-50、51-53、54-58、69-71和74-77。綠條框指示為α1-AT洗脫液。CHT純化轉基因羊奶中的重組人α1-抗胰蛋白酶

羥基磷灰石（CHT）PI其中，α1-AT，pI＝5.27α乳白蛋白，pI＝5.16β-乳球蛋白,pI=4.775.274.775.16當前第72頁\共有115頁\編于星期四\19點Markettrendoftherapeuticantibodies

Twentyapprovedantibodytherapeuticscurrentlyavailableforthetreatmentofvariousdiseases-Reopro,Rituxan,Herceptin,Remicade,Synagis,Avastin,Erbitux,Xolair,Raptiva,Lucentis,Tysabri,etc. Theantibodytherapeuticsmarketisexpectedtogrowbyabout30%annuallyreachingexcessof$22billionby2007.

Reference:當前第73頁\共有115頁\編于星期四\19點ProductionofMonoclonalsFermentationHarvestRecoveryDownstreamProcessingBulkDrugSubstance當前第74頁\共有115頁\編于星期四\19點MonoclonalsDownstreamProcess–AGenericApproach當前第75頁\共有115頁\編于星期四\19點CriticalcontaminantsindownstreamprocessdevelopmentContaminantsMolecularweightsIsoelectricpointsIgGAggregates>300,000SameasIgGProteinA42,0004.9-5.1DNA1,000-1,000,000HighlyacidicEndotoxin>100,000HighlyacidicHostcellproteinsVaryVariousViruses>1,000,000<7formost當前第76頁\共有115頁\編于星期四\19點RetentionofaggregatesAggregatestendtobindCHTmorestronglythan“monomeric”IgG.ThisindicatesthatthebindingcharacteristicsoftheindividualIgGmoleculesinanaggregateareadditive.Thelargertheaggregate,thestrongerthebinding.AggregateremovalinNaClgradientsatlowconcentrationsofphosphategenerallyprovidesevenbetterseparationthansizeexclusionchromatography,athigherflowrates,andmuchhighercapacity.當前第77頁\共有115頁\編于星期四\19點TheeffectofpHonaggregateseparation15mM10mMpH7.5pH6.5Sodiumchloridegradientatconstant5mMNaPO41.5MNaCl0.5MPO4proteinApurifiedIgGonCHTtypeI20μm當前第78頁\共有115頁\編于星期四\19點TheeffectofPO4onaggregateseparation1MNaCl0.5MPO415mM10mM25mMPO4IndicatedphosphateconcentrationmaintainedacrossthesodiumchloridegradientproteinApurifiedIgGonCHTtypeI20μm當前第79頁\共有115頁\編于星期四\19點DOEtoOptimizeResolutionofAggregates當前第80頁\共有115頁\編于星期四\19點ContourplotofpHandPO4onaggregateresolutionResolutionfactor=2[tB-tA]/(WA+WB)wheretandWcorrespondtotheretentiontimeandpeakwidthatbaselinerespectively.Reference:PKNget.al.JournalofChromatographyA,1142(2007)13-18當前第81頁\共有115頁\編于星期四\19點AnalysisofCHTfractionsHPSECofCHTfractionsBio-Silect400-550μLsample,0.8mL/min50mMHEPES,1.0MNaCl,2Murea,pH7.2

CHTpoolfrom0.5MPO4cleaning

NativeIgGpoolfromNaClgradientIgGpoolfromproteinANativeIgGElutionZone當前第82頁\共有115頁\編于星期四\19點RetentionofproteinATheelutionzonesforfree*proteinAandfreeIgGoverlaptovaryingdegrees.HoweveritisimportanttorememberthatproteinAisnot“free”undermostconditions:itisaffinity-complexedwithIgG.AswithIgGaggregates,thebindingcharacteristicsofIgGandproteinAareapparentlyadditiveinthecomplex.WhenelutionisconductedwithNaClataconstantlowconcentrationofphosphate,proteinA-IgGcomplexeselutemuchlaterandwellseparatedfromfreeIgG.ProteinA-IgGcomplexeselutemostlyinthe0.5MNaPO4cleaningstep.Greaterthan90%reductionispossibleinasinglestep.當前第83頁\共有115頁\編于星期四\19點RetentionoffreeproteinAvsIgGPhosphategradientelutionatdifferentconcentrationsofNaClCHT,typeI,40μmGreenproteinA,GrayIgG0.0MNaCl0.3MNaCl當前第84頁\共有115頁\編于星期四\19點RetentionoffreeproteinAvsIgGNaClgradientelutionatdifferentphosphateconcentrationsCHT,typeI,20μmGreenproteinA,GrayIgG5mMPO420mM10mM當前第85頁\共有115頁\編于星期四\19點RetentionofDNAThebindingofDNAisdominatedbymetalaffinitywithCHTcalcium.Thisalsoappliestootherphosphorylatedcontaminantssuchasendotoxins.Phosphateconcentrationsof200–400mMarerequiredforelution.WhenIgGiselutedinaNaClgradientatlowphosphateconcentration,DNAreductionofmorethan3logsispossible.Endotoxinreductionunderthesameconditionsismorethan4logs.當前第86頁\共有115頁\編于星期四\19點RetentionofDNAonCHT+0.50MNaCl+1.0MNaCl0.80MPO4+0.25MNaCl10mMPO4+0.00MNaClShearedsalmonspermDNA

CHTtypeI,40micron,600cm/hrpH7.0當前第87頁\共有115頁\編于星期四\19點RetentionofDNA/RNAonCHT當前第88頁\共有115頁\編于星期四\19點RemovalofvirusesacrossCHTAttribute/VirusX-MuLVMVMFamilyRetroviridaeParvoviridaeNucleicAcidssRNAssDNAEnvelopedYesNoSize80-120nm18-26nmResistanceto

PhysicochemicalAgentsLowHighLogclearance(March2006)(January2008)>3>322當前第89頁\共有115頁\編于星期四\19點RetentionofendotoxinsEndotoxinsarehighlyacidicduetoahighcontentofphosphorylandcarboxylresidues.BothshouldhavestrongaffinityforCHTcalcium.Elutionintheabsenceofphosphateshouldnotoccur.SomeendotoxinshaveaminogroupswhichmaycationexchangewithCHTphosphatesatlowionicstrength.Endotoxinsoccurinarangeofaggregationstates,intothemillionsofDaltons.MostofthechargesareinternalizedbecauseoftheirassociationwiththehydrophobiclipidAregion.Bothsizeandchargeshieldingmayaffectretention.Endotoxinsarefrequentlycomplexedwithproteinsandothercellwallcomponentsthatmayalsoinfluenceretention當前第90頁\共有115頁\編于星期四\19點IgGzoneIgGzoneNaCl0-1.5MCleanwith0.5MPO4PO40-0.3MCleanwith0.5MPO4AffinityofendotoxinstoCHTLPSmixturefromE.Coli,SalmonellaandPseudomonas

CHTtypeI,40micron,300cm/hr當前第91頁\共有115頁\編于星期四\19點Removalofhostcellproteins(HCP)HCPareuniqueforeachcellline.HundredstothousandsofHCPsderivedfromcellorcelldebrisarepresentinfermentorfluid.BulkofHCPsisremovedacrossproteinAchromatography.MixedmodeinteractionwithCHTcanofferuniqueopportunityforremovalofresidualHCPs.當前第92頁\共有115頁\編于星期四\19點TheeffectofNaClandphosphateonCHOPclearance

CHOprotein(ppm)ProteinAeluate58.3NaClgradientpool<1PO4gradientpool31當前第93頁\共有115頁\編于星期四\19點CHTfractionationofcontaminantsProteinA-purifiedhumanIgG1

CHTtypeI,20micron,300cm/hr20mMNaPO4,pH6.540CVlineargradientto1MNaCl(20mMPO4)Cleanwith0.5MNaPO4MonomerAggregate(tetramer)dnaetoxpaLargeraggregates當前第94頁\共有115頁\編于星期四\19點2-StepPlatformPurification,proteinA/CHTEluteproteinAwith0.1Mglycine*orarginine*0.05MNaCl,pH3.8(nocitrateorEDTA).Holdforviralinactivation.RaisepHto6.5byadditionof0.5MNaPO4pH10.5,1%v:v.EquilibrateCHTto5mMNaPO4,pH6.5RunoptimizedCHTfractionationconditions*Glycineandarginineconcentrationcanberaisedto1-2Mtoreduceaggregation.當前第95頁\共有115頁\編于星期四\19點2-Stepplatform(ChimericIgG),Case1

OM PPA PCHTAggregate%IgG----- >40 <1 ProteinAng ----- 162 6DNAng 9.9x105 3.8x104 12EndotoxinEU 2.6x103 5.0x102 <0.05IgG% 100 25* 45*OM:originalmaterialPPA:IgGpoolfromproteinAPCHT:nativeIgGpoolfromCHT*lowrecoveryPPAduetoaggregation;PCHTduetoaggregateremoval當前第96頁\共有115頁\編于星期四\19點ThreeStepPlatformPurification,conditionsEluteproteinAwith0.1Mglycine,0.05MNaCl,pH2.5(nocitrateorEDTA).RaisepHto3.8byadditionof1MTrispH8.5,4.9%v:v.Holdforviralinactivation(seereference)RaisepHto7.0byadditionof1MTrispH8.5,2.3%v:v.Thiswillyieldaconductivityof~9mS.EquilibrateUNOsphereQcolumnto0.07MTris,0.1Mglycine,pH7.0,flow-throughmodeReducepHto6.5byadditionof0.5MmonobasicNaPO4(pH~4.1),1%v:v.EquilibrateCHTwith5mMNaPO4,pH6.5Load,wash,20CVlineargradientto1.5MNaCl*Cleanwith0.5MNaPO4* screeningconditions,increaseto10mMifIgGdoesnotelute當前第97頁\共有115頁\編于星期四\19點3-StepPlatformpurification,summaryUNOsphereSUPrACHTUNOsphere

Q4123123452450SHPSECBio-SilectSEC400-550mMHEPES0.5MNaCl2Murea,pH7當前第98頁\共有115頁\編于星期四\19點3Step-PlatformPurification,summaryAggregateremovalbyCHTMorethan99%reductionbyHPSECLeachedproteinAremovalbyCHT90%removalbyCygnusELISAreducedfrom55to5ng/mLDNAremovalbyCHT>3logsreductionbyPCRreducedto<1ng/mLbypicogreenEndotoxinremovalbyCHTSpikedwithLPSfromE.coli,Salmonella,andP.aeruginosaremoved7x104EUbyLALfinalconcentration,IgGpool,1EU/mL當前第99頁\共有115頁\編于星期四\19點基于生物分子表面疏水性不同而達到分離的技術疏水作用來自于分子的水化結構，高濃度鹽溶液破壞生物分子的水化結構，使蛋白質內部的疏水基團暴露于分子外表面，從而可與疏水介質結合不同離子的疏水性Anions:SO42->Cl->Br->NO3->ClO4->I->SCN-Cations:Mg2+>Li+>Na+>K+>NH4+蛋白質以高濃度鹽溶液結合與疏水層析柱上，以低濃度鹽溶液洗脫原理疏水層析MacroPrepMethylHICMacroPrept-ButylHIC產品當前第100頁\共有115頁\編于星期四\19點疏水層析生物分子表面大都有或強或弱的疏水區(qū)域，在不同環(huán)境下，與各種疏水介質產生不同強弱的結合高離子強度可加強疏水性跟離子交換相反，高鹽吸附，低鹽洗脫；洗脫樣品又可直接或稍加稀釋后加上其他層析柱，作為連接層析步驟的橋梁，取代鹽析沉淀技術比反相層析的配體密度低很多，無須有機溶劑洗脫，保存生物活性配體種類繁多，很難預測哪一種、哪一個條件最適合，可用疏水層析試盒選擇介質當前第101頁\共有115頁\編于星期四\19點作用原理溶質曝露在外的疏水基配基水分子大量水分子DG=DH-T

DS當前第102頁\共有115頁\編于星期四\19點為什么使用疏水層析?離子交換技術、羥基磷灰石、凝膠過濾技術、親和層