淺論Tim4基因定量檢測(cè)方法的建立及在消化道腫瘤中的初步應(yīng)用【摘要】目的：建立T細(xì)胞免疫球蛋白及黏蛋白域分子4(Tcellsimmunoglobulinandmucindomaincontainingmolecule4，Tim4)基因表達(dá)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR(實(shí)時(shí)RTPCR)的檢測(cè)方法，探討Tim4基因在消化道腫瘤中的表達(dá)差異。方法：構(gòu)建包含Tim4基因片段的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，通過(guò)RTPCR，實(shí)時(shí)RTPCR等檢測(cè)并比較Tim4基因在37例胃癌組織、19例結(jié)直腸癌組織與對(duì)應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)水平。結(jié)果：建立的Tim4基因定量檢測(cè)方法準(zhǔn)確可靠；在37例胃癌組織中，26例癌旁組織Tim4基因表達(dá)量高于對(duì)應(yīng)癌組織(26/37)，且在26例癌旁組織高表達(dá)的樣本中，18例胃癌癌旁組織與癌組織表達(dá)比率大于2；在19例結(jié)直腸癌中12例癌旁組織表達(dá)高于對(duì)應(yīng)的癌組織(12/19)，其中癌旁組織高表達(dá)率為%(9/12)。結(jié)論：成功建立了檢測(cè)Tim4基因的實(shí)時(shí)RTPCR方法，Tim4基因在結(jié)直腸癌和胃癌的癌組織中表達(dá)呈低趨勢(shì)，這為深入探討Tim4基因與腫瘤的關(guān)系提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

【關(guān)鍵詞】T細(xì)胞免疫球蛋白及黏蛋白域分子4；實(shí)時(shí)熒光定量RTPCR；胃癌；結(jié)直腸癌

［Abstract］Objective:ToestablishamethodofrealtimeRTPCRforTcellsimmunoglobulinandmucindomaincontainingmolecule4(Tim4)andinvestigateitsexpressionincolorectalcancerandgastric：ThestandardplasmidofTim4genewasfirstlylevelsofexpressionofTim4inthetumortissuesof37patientswithgastriccancerand19patientswithcolorectalcancerweredetectedbyRTPCRandrealtimePCR.Results：ThestandardquantitativecurveofTim4genewasgenerated(correlationcoefficientr=).TherealtimeRTPCRforTim4wasaccurateandexpressionofTim4geneinthegastriccancertissues(26/37)waslowerthanthatinthematchingadjacentnoncanceroustissues.TherateofhigherexpressionofTim4gene(2)inadjacentnoncanceroustissues/gastriccancertissueswas%(18/26).Likewise,12samplesexpressionofTim4geneinthecolorectalcancertissuesof19patientswerelowerthanthatinthematchingadjacentnoncanceroustissues,therateofhigherexpressionofTim4gene(2)inadjacentnoncanceroustissueswas%(9/12).Conclusion：AstablerealtimeRTPCRhasbeensuccessfullyestablishedfordetectionofTim4geneofTim4geneisloweringastriccancerandcolorectalcancertissues,andprovideaplatformforTim4andcancerstudies.

［Keywords］Tcellsimmunoglobulinandmucindomaincontainingmolecule4；realtimeRTPCR；gastriccancer；colorectalcancer

T細(xì)胞免疫球蛋白及黏蛋白域分子4也稱為T(mén)imd4，是有調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫應(yīng)答作用的Tim基因家族的成員［1］，主要表達(dá)于抗原遞呈細(xì)胞,特別是成熟的樹(shù)突狀淋巴細(xì)胞，能與Tim1特異性結(jié)合而調(diào)節(jié)T細(xì)胞增殖［2］。近年研究顯示，Tim4是磷脂酰絲氨酸的受體，能通過(guò)磷脂酰絲氨酸與細(xì)胞結(jié)合而促進(jìn)凋亡細(xì)胞的吞噬作用［3］。由于Tim4與凋亡關(guān)系密切，這使我們關(guān)注其與干細(xì)胞及腫瘤的相關(guān)性，為此本研究在建立定量RTPCR檢測(cè)Tim4基因表達(dá)的基礎(chǔ)上，初步探討該基因在結(jié)直腸癌和胃癌組織中的表達(dá)水平，為深入探討Tim4與腫瘤的相關(guān)性提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1材料和方法

細(xì)胞與患者標(biāo)本

人臍帶來(lái)源的間質(zhì)干細(xì)胞，人胃癌細(xì)胞株；胃癌標(biāo)本37例，其中男23例，女14例，年齡44～75歲,中位年齡61歲。結(jié)直腸癌標(biāo)本19例，其中男12例，女7例，年齡37～84歲,中位年齡63歲。所有病例取自2008年1月至2009年5月江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院和江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院外科收治并經(jīng)病理組織學(xué)確診的手術(shù)切除標(biāo)本，術(shù)前均未接受化療及放療，所取患者標(biāo)本皆為成對(duì)的癌組織和癌旁組織(距癌變部位邊界5cm以外且經(jīng)病理證實(shí)無(wú)癌變的組織)。

方法

總RNA提取和逆轉(zhuǎn)錄

培養(yǎng)的細(xì)胞取107個(gè)，組織標(biāo)本取50mg研碎，各加Trizol試劑(Invitrogen公司)提取總RNA。提取的總RNA經(jīng)鑒定后取完整性好的樣品，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(MBI)以O(shè)ligo(dT)為引物，合成cDNA。

引物設(shè)計(jì)

參照基因庫(kù)提供的人Tim4mRNA的完整序列設(shè)計(jì)引物。Tim4,β肌動(dòng)蛋白基因的引物皆跨外顯子設(shè)計(jì)，引物序列和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度見(jiàn)表1。

RTPCR

反應(yīng)體系為10×緩沖液(含Mg2+)μl，10mmol/LdNTPμl，10pmol/μl的上下游引物各μl，5U/μlTaq酶μl，模板cDNA1μl，加ddH2O補(bǔ)足至25μl。PCR循環(huán)參數(shù)：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，Tim4(58℃)，β肌動(dòng)蛋白(56℃)退火30s，72℃延伸30s，30個(gè)循環(huán)；72℃10min。瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。表1Tim4,β肌動(dòng)蛋白基因引物序列

Tim4標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒制備

從ucMSC細(xì)胞中經(jīng)RTPCR擴(kuò)增出Tim4的cDNA片段和β肌動(dòng)蛋白的cDNA片段，使用TA克隆試劑盒，將純化的PCR產(chǎn)物連接入pMD18T載體，轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)菌，篩選陽(yáng)性克隆，擴(kuò)菌后純化提取質(zhì)粒，倍比稀釋質(zhì)粒以繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

定量RTPCR

反應(yīng)體系：2×SYBRGreenRealtimePCRMasterMix10μl，μlcDNA模板，引物各μl(10pmol/μl),用ddH2O補(bǔ)足至20μl。PCR循環(huán)參數(shù)：95℃預(yù)變性5min，使用4步法擴(kuò)增，具體為94℃30s,58℃(Tim4)/56℃(β肌動(dòng)蛋白)30s,72℃30s,85℃(Tim4)/88℃(β肌動(dòng)蛋白)8s后檢測(cè)熒光，35個(gè)循環(huán)。

統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS系統(tǒng)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，配對(duì)資料比較采用Wilcoxon′ssignedranktests。

2結(jié)果

實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增Tim4

以107～102拷貝/μl的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為模板擴(kuò)增Tim4基因，標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)為；經(jīng)融解曲線分析顯示，在85℃檢測(cè)熒光，可排除引物二聚體等的干擾，標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒擴(kuò)增特異。以β肌動(dòng)蛋白為內(nèi)參照，同樣繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)?？截悢?shù)為109～104拷貝/μl，相關(guān)系數(shù)為，88℃檢測(cè)熒光同樣可排除非特異擴(kuò)增的干擾。

RTPCR檢測(cè)Tim4基因的表達(dá)

采用RTPCR方法擴(kuò)增了細(xì)胞和組織標(biāo)本，結(jié)果顯示人臍帶間質(zhì)干細(xì)胞與人胃癌細(xì)胞皆有Tim4mRNA的表達(dá)，但SGC7901細(xì)胞中表達(dá)極弱。在37例胃癌成對(duì)標(biāo)本中，癌旁組織和配對(duì)胃癌組織皆有擴(kuò)增，但擴(kuò)增條帶有強(qiáng)弱之分。19例結(jié)直腸癌與配對(duì)癌旁組織研究與胃癌中的結(jié)果類(lèi)似。

實(shí)時(shí)定量PCR分析Tim4在胃癌和結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)

在構(gòu)建的Tim4標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線基礎(chǔ)上，以β肌動(dòng)蛋白的表達(dá)量為內(nèi)參照，通過(guò)兩者的比值分析Tim4基因在癌組織和癌旁組織中的表達(dá)差異，結(jié)果顯示在37例胃癌成對(duì)標(biāo)本中，26例癌旁組織中的Tim4表達(dá)高于癌組織，且在26例癌旁組織高表達(dá)的樣本中，18例胃癌癌旁組織與癌組織表達(dá)比率大于2，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。19例結(jié)直腸癌和配對(duì)癌旁組織標(biāo)本中，12例標(biāo)本癌旁組織的Tim4表達(dá)高于癌組織(12/19)，在19例結(jié)直腸癌中12例癌旁組織表達(dá)高于對(duì)應(yīng)的癌旁組織，其中癌旁組織表達(dá)高于癌組織2倍的有9例,差異同樣無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3討論

Tim基因家族是2003年新發(fā)現(xiàn)的具有調(diào)節(jié)Th1，Th2細(xì)胞介導(dǎo)免疫應(yīng)答作用的基因家族［1］。人類(lèi)Tim基因家族由3個(gè)成員組成，即Tim1，Tim3，Tim4，位于染色體。Tim4是Tim1的配體，主要表達(dá)于抗原遞呈細(xì)胞,特別是成熟的樹(shù)突狀淋巴細(xì)胞，涉及Th1Th2細(xì)胞的平衡。Khademi等［4］研究發(fā)現(xiàn)，Tim蛋白可能涉及Th1和Th2細(xì)胞介導(dǎo)的疾病，如多發(fā)性硬化癥等，現(xiàn)主要研究多集中在對(duì)Tim多態(tài)性與自身免疫性疾病、過(guò)敏性疾病的相關(guān)性方面［5,6］。

鑒于Tim4與細(xì)胞凋亡關(guān)系密切，本研究首先建立了檢測(cè)人Tim4基因表達(dá)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法，為T(mén)im4基因的定量檢測(cè)提供可能；初步探討其在不同腫瘤組織，如胃癌和結(jié)直腸癌中的表達(dá)水平。研究結(jié)果顯示，在大多數(shù)胃癌和結(jié)直腸癌患者中，Tim4在癌組織中的表達(dá)低于配對(duì)的癌旁組織，但無(wú)論在胃癌還是結(jié)直腸癌，癌組織和癌旁組織中的Tim4mRNA表達(dá)水平并無(wú)顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這可能與樣本例數(shù)較少，腫瘤標(biāo)本未分期等相關(guān)，可進(jìn)一步擴(kuò)大標(biāo)本量，從蛋白水平探討Tim4在腫瘤中的表達(dá)，并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行深入研究。

本研究建立的檢測(cè)Tim4基因表達(dá)的實(shí)時(shí)定量PCR方法特異性好，敏感性高，線性范圍廣且結(jié)果穩(wěn)定可靠，可用于其他腫瘤組織或腫瘤患者血清學(xué)中Tim4的定量分析。本研究顯示Tim4基因在胃癌和結(jié)直腸癌的癌組織中均有不同程度表達(dá)，腫瘤標(biāo)本中Tim4基因表達(dá)的定量檢測(cè)可能提供一些新的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，Tim4與腫瘤的相關(guān)性值得探討。

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