實驗四微生物菌落的觀察和細菌的運動觀察實驗四微生物菌落的觀察和細菌的運動觀察第1頁目要求學會觀察、識別各種不一樣微生物菌落方法。掌握平板菌落計數(shù)方法，利用所學知識詳細描述所分離平板上各種微生物菌落。了解普通光學顯微鏡結(jié)構(gòu)和原理，熟悉其使用正確方法。

學習并掌握油鏡使用方法，學會用壓滴法或懸滴法觀察細菌運動性基礎(chǔ)技術(shù)。實驗四微生物菌落的觀察和細菌的運動觀察第2頁實驗原理

對于一些難區(qū)分菌落還應(yīng)該借助顯微鏡來觀察其細胞形態(tài)以深入做出正確判斷。微生物類別菌落特征單細胞微生物菌絲狀微生物細菌酵母菌放線菌霉菌主要特征細胞形態(tài)特征小而均勻個別有芽孢大而分化細而均勻粗而分化相互關(guān)系單個分散或按一定方式排列單個分散或假絲狀絲狀交織絲狀交織菌落含水情況很濕或較濕較濕干燥或較干燥干燥外觀特征小而突起或大而平坦大而突起小而緊密大而疏松或大而致密參考特征菌落透明度透明或稍透明稍透明不透明不透明菌落與培養(yǎng)基結(jié)合度不結(jié)合不結(jié)合牢靠結(jié)合較牢靠結(jié)合菌落顏色多樣單調(diào)十分多樣十分多樣菌落正反面顏色差異相同相同普通不一樣普通不一樣細胞生長速度普通很快較快慢普通較快氣味普通有臭味多帶酒香常有泥腥味霉味實驗四微生物菌落的觀察和細菌的運動觀察第3頁

（一）普通光學顯微鏡結(jié)構(gòu)：

1、機械個別：鏡臂、鏡座、粗調(diào)整器、細調(diào)整器、聚光升降螺旋、載物臺等。---支持、調(diào)整、固定等作用

2、光學系統(tǒng)：接物鏡、接目鏡、照明裝置、聚光器等。1.物鏡轉(zhuǎn)換器2.接物鏡3.游標卡尺4.載物臺5.聚光器6.彩虹光闌7.光源8.鏡座9.電源開關(guān)10.光源滑動變阻器11.粗調(diào)螺旋12.微調(diào)螺旋13.鏡臂14.鏡筒15.目鏡16.標本移動螺旋實驗四微生物菌落的觀察和細菌的運動觀察第4頁

顯微鏡放大倍數(shù)和分辨率

1.放大倍數(shù)=接物鏡放大倍數(shù)×接目鏡放大倍數(shù)

2.

顯微鏡分辨率

是表示顯微鏡辨析物體（兩端）兩點之間距離能力。實驗四微生物菌落的觀察和細菌的運動觀察第5頁D：物鏡分辨出物體兩點間最短距離；NA，數(shù)值孔徑，是物鏡參數(shù)之一；

：入射光波長（可見光平均0.55m)n:

物鏡和被檢標本間介質(zhì)折射率；（空氣為1.0，水為1.33，玻璃為1.5，甘油為1.47，香柏油為1.52。）

：鏡口角（即入射角）：是指從物鏡光軸上物點發(fā)出光線與物鏡前透鏡有效直徑邊緣所張角度。比如，肉眼所能感受光波平均長度為0.55μm，假如NA=0.65接物鏡，它分辨力D=?*0.55/0.65=0.42μm以下兩點間距離就分辨不出來了，即使使用倍數(shù)更大接目鏡使其總放大率增加也仍分辨不出，只有改用數(shù)值孔徑更大接物鏡才行。顯微鏡分辨率可用公式表示為：D=λ/2NA

=λ/2nsin(α/2)實驗四微生物菌落的觀察和細菌的運動觀察第6頁（二）油鏡使用原理油鏡，即油浸接物鏡。當光線由反光鏡經(jīng)過玻片與鏡頭之間空氣時，因為空氣與玻片密度不一樣，使光線受到波折，發(fā)生散射，降低了視野照明度。加入中間介質(zhì)是一層香柏油（其折射率與玻片相近），則幾乎不發(fā)生折射，增加了視野進光量，從而使物象愈加清楚。實驗四微生物菌落的觀察和細菌的運動觀察第7頁實驗材料試驗三所作平板培養(yǎng)物：A，在細菌培養(yǎng)基上生長各種菌落；B，在霉菌培養(yǎng)基上生長各種菌落。試驗二所作試管斜面，酒精燈、接種環(huán)等。蓋玻片、凹玻片、接種環(huán)、酒精燈。菌種：大腸桿菌E.coli，枯草桿菌B.subtilis或試驗三所培養(yǎng)菌種實驗四微生物菌落的觀察和細菌的運動觀察第8頁實驗程序Ⅰ（觀察描述菌落特征）利用所掌握各種微生物菌落特點，觀察、識別、描述所做樣品兩個平板上全部菌落,并將結(jié)果填入表1中。常見菌落描述詞語：大?。捍?、中、小、針尖狀形狀：圓形、隆起、扁平、假根狀、不規(guī)則狀等；邊緣情況：整齊、波形、裂葉狀、鋸齒狀等表面情況：干燥、濕潤、光滑、皺褶、顆粒狀、龜裂狀等；實驗四微生物菌落的觀察和細菌的運動觀察第9頁樣品起源培養(yǎng)基類型菌落類型特征描述菌落數(shù)（近似值）大小形狀顏色表面情況邊緣情況

A1A2B3B4

A1A2B3B4表1平板菌落特征描述實驗四微生物菌落的觀察和細菌的運動觀察第10頁定義:依據(jù)微生物在固體培養(yǎng)基上所形成單個菌落是由一個單細胞繁殖而成這一培養(yǎng)特征而設(shè)計計數(shù)方法，即一個菌落代表一個單細胞。統(tǒng)計菌落數(shù)目，即可計算出樣品中含菌數(shù)。此法所計算菌數(shù)是培養(yǎng)基上長出來菌落數(shù)，故又稱活菌計數(shù)。對土壤中微生物進行計數(shù),將結(jié)果填入表2中。實驗程序Ⅱ（平板菌落計數(shù)）實驗四微生物菌落的觀察和細菌的運動觀察第11頁表2土壤中微生物計數(shù)結(jié)果

稀釋度10-510-61g樣品活菌數(shù)12平均12平均細菌菌落數(shù)霉菌菌落數(shù)計數(shù)方法:每克土壤菌數(shù)=同一稀釋度幾次重復(fù)菌落平均數(shù)×稀釋倍數(shù)

計算結(jié)果時，常按以下標準從接種后2個或3個稀釋度中選擇一個適當稀釋度，求出每克菌劑中含菌數(shù)。

（1）同一稀釋度各個重復(fù)菌數(shù)相差不太懸殊。

（2）細菌、放線菌、酵母菌以每皿30—300個菌落為宜，霉菌以每皿10—100個菌落為宜。選擇好計數(shù)稀釋度后，即可統(tǒng)計在平板上長出菌落數(shù)，統(tǒng)計結(jié)果按下式計算。實驗四微生物菌落的觀察和細菌的運動觀察第12頁實驗程序Ⅲ顯微鏡（油鏡）使用：

1、用前檢驗：零件是否齊全，鏡頭是否清潔。

2、打開光源，調(diào)整光亮度

3、低倍鏡觀察：粗調(diào)、細調(diào)

4、依次再進行中倍、高倍觀察

5、油鏡觀察：高倍鏡下找到清楚物象后，提升聚光鏡，在標本中央滴一滴香柏油，使油鏡鏡頭浸入香柏油中，細調(diào)至看清物象為止。

6、換片：另換新片，必須從第三條開始操作。

7、用后復(fù)原：觀察完成，上懸鏡筒，先用擦鏡紙擦去鏡頭上油，然后再用擦鏡紙沾取少許二甲苯擦去殘留油，最終用擦鏡紙擦去殘留二甲苯，后將鏡體全部復(fù)原。一、結(jié)合標本片觀察，掌握油鏡使用方法；觀察各類微生物染色片，邊觀察邊繪圖。實驗四微生物菌落的觀察和細菌的運動觀察第13頁二、細菌運動性觀察（壓滴法

）：(1)

制備菌液：從幼齡菌斜面上，挑數(shù)環(huán)菌放在裝有1～2mL無菌水試管中，制成輕度混濁菌懸液。(2)

取2～3環(huán)稀釋菌液于潔凈載玻片中央，再加入一環(huán)0.01%美藍水溶液，混勻。(3)

用鑷子夾一潔凈蓋玻片，先使其一邊接觸菌液，然后慢慢地放下蓋玻片，這么可預(yù)防產(chǎn)生氣泡。(4)

鏡檢：將光線適當調(diào)暗，先用低倍鏡找到觀察部位，再用高倍鏡觀察。要區(qū)分細菌鞭毛運動和布朗運動，后者只是在原處左右擺動，細菌細胞間有顯著位移者，才能判定為有運動性。實驗四微生物菌落的觀察和細菌的運動觀察第14頁二、細菌運動性觀察（懸滴法）：1.制備菌液：在幼齡菌斜面上，滴加3-4mL無菌水，制成輕度混濁菌懸液。2.涂凡士林：取潔凈無油蓋玻片1塊，在其四面涂少許凡士林（或香柏油）。3.滴加菌液：加1滴菌液于蓋玻片中央，并用記號筆在菌液邊緣做一記號，方便在顯微鏡觀察時，易于尋找菌液位置。實驗四微生物菌落的觀察和細菌的運動觀察第15頁4.蓋凹玻片

將凹玻片凹槽對準蓋玻片中央菌液，并輕輕地蓋在蓋玻片上，使二者粘在一起，然后翻轉(zhuǎn)凹玻片，使菌液恰好懸在凹槽中央，再用鉛筆或火柴棒輕壓蓋玻片，使玻片四面圍緣閉合，以防菌液干燥。5.鏡檢

先用低倍鏡找到標識，再稍微移動凹玻片即可找到菌滴邊緣，然后將菌液移到視野中央換高倍鏡觀察。因為菌體是透明，鏡檢時可適當縮小光圈或降低聚光器以增大反差，便于觀察。鏡檢時要仔細區(qū)分是細菌運動