分子診斷的臨床應(yīng)用上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)系

樊綺詩(shī)第一頁(yè)，共七十八頁(yè)。

用分子生物學(xué)技術(shù)通過(guò)檢測(cè)基因而達(dá)到診斷疾病的目的是生物學(xué)者在分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)展的最初階段就有的設(shè)想。上世紀(jì)70年代人們開(kāi)始在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行研究，80年代以來(lái)，基因檢測(cè)在許多國(guó)家已成為常規(guī)檢驗(yàn)項(xiàng)目，主要用于感染性和遺傳性疾病等的診斷。第二頁(yè)，共七十八頁(yè)。1953年Watson和Crick提出脫氧核糖核酸的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型。1990年人類基因組計(jì)劃正式啟動(dòng)。2001年2月科學(xué)家宣布完成人類基因組的全部序列圖。第三頁(yè)，共七十八頁(yè)。DNA重組技術(shù)(DNArecombination)轉(zhuǎn)基因技術(shù)(transgenictechnique)基因組學(xué)(genomics)蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)基因治療(genotherapy)生物芯片(biochip)等技術(shù)已應(yīng)用到醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，對(duì)疾病機(jī)理的認(rèn)識(shí)、疾病的診斷、預(yù)防和治療產(chǎn)生了深刻的影響。第四頁(yè)，共七十八頁(yè)。分子診斷不僅能早期對(duì)疾病作出確切的診斷，也能確定個(gè)體對(duì)疾病的易感性，判別致病基因攜帶者并對(duì)疾病的分期、分型、療效監(jiān)測(cè)和預(yù)后作出判斷。分子診斷已成為實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)的一個(gè)重要組成部分，成為一門(mén)新的學(xué)科。

MoleculardiagnosisMoleculardiagnostics

第五頁(yè)，共七十八頁(yè)。一、基因檢測(cè)在感染性疾病中的應(yīng)用第六頁(yè)，共七十八頁(yè)。SARS相關(guān)冠狀病毒的分子診斷2003年4月，香港研究者Peiris等報(bào)告了50例嚴(yán)重型急性呼吸道綜合征(seriousacuterespiratorysyndrome,SARS)病人的臨床表現(xiàn)和病毒學(xué)研究結(jié)果。一種新的冠狀病毒(Coronavirus)是SARS的致病原因。

(Lancet,2003,361:9365)第七頁(yè)，共七十八頁(yè)。第八頁(yè)，共七十八頁(yè)。檢測(cè)標(biāo)本痰液、咽拭子、鼻拭子、支氣管肺泡灌洗液、血漿、糞便。檢測(cè)方法1.逆轉(zhuǎn)錄-巢式PCR(Reverse-NestedPCR)2.逆轉(zhuǎn)錄-實(shí)時(shí)PCR(Reverse-RealtimePCR)第九頁(yè)，共七十八頁(yè)。有報(bào)道顯示，在可能SARS病人中病毒的檢出率為100%。在疑似SARS病人中的檢出率為23%。所有健康接觸者中未檢測(cè)到病毒。第十頁(yè)，共七十八頁(yè)。另一項(xiàng)研究顯示檢測(cè)病毒的3種方法（血清學(xué)檢測(cè)、病毒分離、PCR技術(shù)）中，PCR技術(shù)的檢出率最高。第十一頁(yè)，共七十八頁(yè)。討論P(yáng)CR技術(shù)在疾病的早期即可獲得陽(yáng)性結(jié)果(早于血清轉(zhuǎn)換期）。SARS患者中的陽(yáng)性率約為80%，提示(當(dāng)時(shí)的)PCR方法有較高的特異性但靈敏度較差，陰性結(jié)果不能排除病毒感染。對(duì)照中的陰性率約為98%~100%。第十二頁(yè)，共七十八頁(yè)。討論痰液中病毒RNA濃度極高，說(shuō)明病毒從呼吸道排放是主要傳播途徑。血清中檢測(cè)到極低濃度的病毒RNA，提示病毒復(fù)制不僅發(fā)生于呼吸道。病人恢復(fù)晚期的糞便中存在病毒RNA，說(shuō)明糞便可能也是一種傳播途徑。鼻、咽拭子中含有的病毒RNA顯著少于痰液，提示不適合作為標(biāo)本（有可能漏檢）。第十三頁(yè)，共七十八頁(yè)。SARS相關(guān)冠狀病毒基因檢測(cè)必須注意的問(wèn)題必須在規(guī)范的基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。應(yīng)采取必要的質(zhì)控規(guī)程，包括陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。陽(yáng)性結(jié)果時(shí)必須對(duì)原始樣本重復(fù)檢驗(yàn)：或者擴(kuò)增另一個(gè)基因片段或在另一個(gè)實(shí)驗(yàn)室對(duì)同一樣本進(jìn)行檢測(cè)。第十四頁(yè)，共七十八頁(yè)。HPV基因的檢測(cè)

在預(yù)防宮頸癌中的作用

第十五頁(yè)，共七十八頁(yè)。宮頸癌是常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤之一，發(fā)病率在女性惡性腫瘤中居第二位，每年約有50萬(wàn)左右新發(fā)病例。我國(guó)每年有新發(fā)病例約13.15萬(wàn)，占世界宮頸癌新發(fā)病例總數(shù)的26%。

第十六頁(yè)，共七十八頁(yè)。持續(xù)的人乳頭瘤病毒(humanpapillomavirus,HPV)感染是引起宮頸癌和癌前病變的必要因素，93.0%-99.7%的宮頸癌組織中均可檢測(cè)到HPVDNA。高危型HPV-16和HPV-18分別占宮頸癌的50%和14%。高危型HPV的持續(xù)感染可使患宮頸癌的風(fēng)險(xiǎn)增加250倍。

第十七頁(yè)，共七十八頁(yè)。HPVDNA的檢測(cè)方法實(shí)時(shí)定量PCR(RealtimePCR)核酸擴(kuò)增技術(shù)核酸雜交捕獲（HybridCaptureⅡ，HCⅡ）核酸雜交+信號(hào)放大技術(shù)第十八頁(yè)，共七十八頁(yè)。HCⅡ可一次檢測(cè)所有致癌的13種高危型HPV。敏感度：對(duì)CINⅡ、Ⅲ和癌的檢出率為98%。陰性預(yù)期值：對(duì)高度鱗狀上皮細(xì)胞病變或更高度病變的陰性預(yù)期值99.9%第十九頁(yè)，共七十八頁(yè)。細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果為意義不明確的非典型細(xì)胞時(shí)，HPV基因的檢測(cè)能預(yù)測(cè)受檢者患宮頸癌的風(fēng)險(xiǎn)。細(xì)胞學(xué)檢查+HPV基因的檢測(cè)是宮頸癌前病變和宮頸癌篩查的最佳方法，成為預(yù)防宮頸癌的關(guān)鍵。第二十頁(yè)，共七十八頁(yè)?；驒z測(cè)在監(jiān)測(cè)移植物排斥中的作用

第二十一頁(yè)，共七十八頁(yè)。關(guān)于多瘤病毒人類多瘤病毒中常見(jiàn)的3種病毒：BK、JC、SV40。BK病毒于1971年首次從腎臟移植受體的尿液中分離出。病毒主要在宿主的細(xì)胞核內(nèi)進(jìn)行復(fù)制。第二十二頁(yè)，共七十八頁(yè)。在美國(guó)，10歲以上的正常人群中60%～80%有BK病毒感染史。感染的病毒多潛伏于腎小管上皮細(xì)胞和尿道上皮細(xì)胞中。BK病毒的重新激活大部分是由于免疫機(jī)制缺陷或大量使用免疫抑制劑后。

第二十三頁(yè)，共七十八頁(yè)。腎臟移植術(shù)后大量使用免疫抑制劑，使BK病毒重新激活，大量復(fù)制。BK病毒復(fù)制進(jìn)一步發(fā)展，成為BK病毒感染的腎間質(zhì)性腎?。˙KVAN）。BKVAN患者中60%~70%會(huì)發(fā)生遠(yuǎn)期的腎臟移植失敗。第二十四頁(yè)，共七十八頁(yè)。BK病毒感染已經(jīng)成為腎臟移植遠(yuǎn)期失敗的重要原因之一。BK病毒感染越來(lái)越受到關(guān)注。第二十五頁(yè)，共七十八頁(yè)。早期無(wú)臨床癥狀，后期癥狀與腎移植排斥和藥物毒性反應(yīng)相似，易引起漏診和誤診。BK病毒感染和移植排斥治療原則相反：BK病毒感染需要降低免疫抑制劑量，而移植排斥則應(yīng)加大用量。第二十六頁(yè)，共七十八頁(yè)。因此， 建立有效的BK病毒檢測(cè)和監(jiān)測(cè)體系是十分必要的。第二十七頁(yè)，共七十八頁(yè)。decoy細(xì)胞BK病毒感染的腎臟小管上皮細(xì)胞脫落至尿液。形態(tài)學(xué)檢測(cè)敏感性較好，但特異性差。細(xì)胞形態(tài)在尿液中很容易破壞。第二十八頁(yè)，共七十八頁(yè)。BK病毒感染的檢測(cè)BK病毒復(fù)制的檢測(cè)血、尿中BK病毒核酸定量檢測(cè)尿液中decoy細(xì)胞檢查尿沉渣涂片原位雜交組織病理學(xué)檢查（判斷腎臟間質(zhì)性腎?。┑诙彭?yè)，共七十八頁(yè)。腎臟移植術(shù)后病人BK病毒檢測(cè)的研究對(duì)象瑞金醫(yī)院腎臟移植術(shù)后2個(gè)月~3年的患者95例正常人標(biāo)本60例研究方法尿沉渣細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測(cè)血、尿中BK病毒DNA的定量檢測(cè)第三十頁(yè)，共七十八頁(yè)。結(jié)果95例患者的尿沉渣形態(tài)學(xué)檢查，35例患者的尿沉渣中出現(xiàn)可疑的病毒感染腎小管上皮細(xì)胞（decoy細(xì)胞）。第三十一頁(yè)，共七十八頁(yè)。尿液中BK病毒核酸定量檢測(cè)14例尿液中檢測(cè)到BKVDNA，病毒載量為4×103~2×109拷貝/ml，平均為5.6×105拷貝/ml。發(fā)生病毒尿的中位時(shí)間為移植術(shù)后14個(gè)月。第三十二頁(yè)，共七十八頁(yè)。3例患者在臨床上出現(xiàn)不明原因的發(fā)熱、白細(xì)胞降低、緩慢的肌酐升高等癥狀，有1例甚至出現(xiàn)了尿道阻塞。臨床上認(rèn)為發(fā)生BKVAN的可能性較大，給予抗病毒治療。第三十三頁(yè)，共七十八頁(yè)。病例1、2治療前：尿液和血漿病毒核酸載量在104/ml~105/ml血肌酐分別為181μmol/L和168μmol/L治療后：血漿和尿液中BK病毒已檢測(cè)不出血肌酐降為160μmol/L和129μmol/L

第三十四頁(yè)，共七十八頁(yè)。病例3治療前尿液中BK病毒核酸載量為2×109拷貝/ml尿沉渣細(xì)胞中見(jiàn)到大量decoy細(xì)胞和炎性細(xì)胞治療后尿液中BK病毒核酸載量降至105拷貝/ml尿沉渣細(xì)胞中decoy細(xì)胞明顯減少第三十五頁(yè)，共七十八頁(yè)。討論文獻(xiàn)報(bào)道BK病毒的復(fù)制感染率為5%～60%，本研究中發(fā)生BK病毒復(fù)制的占14.7%。35例患者中發(fā)現(xiàn)decoy細(xì)胞，僅14例被證實(shí)存在病毒核酸，提示形態(tài)學(xué)檢查特異性差。腎臟移植的患者容易導(dǎo)致包括BK病毒在內(nèi)的多種病毒感染。第三十六頁(yè)，共七十八頁(yè)。因此是否存在BK病毒感染，形態(tài)學(xué)僅作為篩查實(shí)驗(yàn)。病毒核酸定量可有效地動(dòng)態(tài)觀察病毒核酸的復(fù)制。第三十七頁(yè)，共七十八頁(yè)。BK病毒核酸定量檢測(cè)用于檢測(cè)BK病毒是否復(fù)制為是否需要進(jìn)行病理學(xué)檢查提供依據(jù)監(jiān)測(cè)疾病和評(píng)價(jià)治療效果預(yù)防間質(zhì)性腎病，防止移植遠(yuǎn)期失敗第三十八頁(yè)，共七十八頁(yè)。二、遺傳性疾病的分子診斷第三十九頁(yè)，共七十八頁(yè)。分子診斷能夠檢出家系中的致病基因攜帶者或高危個(gè)體，能夠在胎兒出生前判斷其是否為患者，因此分子診斷是降低單基因遺傳病發(fā)病率的根本措施。第四十頁(yè)，共七十八頁(yè)。單基因遺傳病是由于某一基因結(jié)構(gòu)的變化或基因表達(dá)異常而導(dǎo)致的疾病用分子生物學(xué)技術(shù)檢測(cè)致病基因的遺傳缺陷是診斷這類疾病最根本的手段。第四十一頁(yè)，共七十八頁(yè)。遺傳性疾病中常見(jiàn)的分子異常致病基因異常而導(dǎo)致所載有的遺傳信息受到改變，而疾病的發(fā)生則是通過(guò)遺傳物質(zhì)的表達(dá)產(chǎn)物——蛋白質(zhì)（或酶等）的表現(xiàn)異常所致。基因突變主要包括點(diǎn)突變、片段性突變和動(dòng)態(tài)性突變。第四十二頁(yè)，共七十八頁(yè)。點(diǎn)突變(pointmutation)包括錯(cuò)義突變、無(wú)義突變、移碼突變。各種點(diǎn)突變所造成的后果：

蛋白質(zhì)分子量改變蛋白質(zhì)合成量下降無(wú)蛋白質(zhì)合成第四十三頁(yè)，共七十八頁(yè)。片段性突變(fragememtalmutation)核苷酸的丟失和增多缺失：基因中鹼基（遺傳物質(zhì)）的丟失插入：外來(lái)基因片段插入某一基因序列中倍增：基因內(nèi)部某一段序列發(fā)生重復(fù)基因重排：基因組中原來(lái)不在一起的基因由于某些原因組合排列在一起第四十四頁(yè)，共七十八頁(yè)。動(dòng)態(tài)性突變(dynamicmutation)以三核苷酸為單位的重復(fù)序列在傳遞過(guò)程中不穩(wěn)定，會(huì)發(fā)生擴(kuò)展，即子代的重復(fù)次數(shù)往往較親代大為增加，因此又稱動(dòng)態(tài)性突變。

脆性X綜合征：CGG重復(fù)少年脊髓型共濟(jì)失調(diào)：GAA重復(fù)

Huntington?。篊AG重復(fù)……第四十五頁(yè)，共七十八頁(yè)。遺傳性疾病基因診斷的策略（一）直接診斷策略

基因診斷的直接策略是通過(guò)各種分子生物學(xué)技術(shù)檢測(cè)基因的遺傳缺陷，因此直接診斷的前提是被檢測(cè)基因的正常序列和結(jié)構(gòu)必須被闡明。直接診斷由于是直接揭示遺傳缺陷，因而比較可靠。

第四十六頁(yè)，共七十八頁(yè)。DMD的基因檢測(cè)

Duchennemusculardystrophy(DMD)是一種高發(fā)病率、高致殘、高致死的X連鎖的遺傳性疾病，在3500個(gè)活產(chǎn)男嬰中即有一個(gè)患者。DMD基因的全長(zhǎng)為250kb，有79個(gè)外顯子。DMD的最主要遺傳缺陷是外顯子缺失，約占60%~70%。第四十七頁(yè)，共七十八頁(yè)。（二）間接診斷策略

間接診斷的實(shí)質(zhì)是在家系中進(jìn)行連鎖分析，通過(guò)分析，可確定被檢個(gè)體來(lái)自雙親的同源染色體中的哪一條與疾病連鎖（致病染色體），從而判斷該個(gè)體是否帶有致病基因。

間接診斷不是尋找DNA的遺傳缺陷，而是通過(guò)分析DNA的遺傳標(biāo)志的多態(tài)性估計(jì)被檢者患病的可能性。第四十八頁(yè)，共七十八頁(yè)。間接診斷：分析DNA的遺傳標(biāo)志的多態(tài)性

真核生物染色體DNA中存在許多不同程度的重復(fù)序列，根據(jù)DNA序列出現(xiàn)頻率的不同而分為不同類型。第四十九頁(yè)，共七十八頁(yè)。單拷貝序列在基因組中僅出現(xiàn)一次或少數(shù)幾次，大多數(shù)基因(50%-80%)在單倍體中都為單拷貝。第五十頁(yè)，共七十八頁(yè)。中度重復(fù)序列

重復(fù)次數(shù)為數(shù)十至數(shù)萬(wàn)(<105)次，長(zhǎng)度多在300-7000bp，多為不編碼序列，與單拷貝基因間隔排列。如Alu家族、KpnI家族、rRNA等。第五十一頁(yè)，共七十八頁(yè)。高度重復(fù)序列存在于基因組的間隔區(qū)和基因的內(nèi)含子等非編碼區(qū)重復(fù)頻率可高達(dá)106以上，不轉(zhuǎn)錄具高度多態(tài)性，成為有效的遺傳標(biāo)記志已廣泛用于基因定位和基因診斷第五十二頁(yè)，共七十八頁(yè)。雙等位基因(bi-allele）多態(tài)性：限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP）第一代DNA遺傳標(biāo)記，所含信息量有限。

檢測(cè)技術(shù)：Southern印跡技術(shù)第五十三頁(yè)，共七十八頁(yè)。多等位基因多態(tài)性(multi-allele)小衛(wèi)星序列又稱串聯(lián)重復(fù)可變數(shù)目（variablenumbertandemrepeats，VNTR）第二代DNA遺傳標(biāo)志，屬高度重復(fù)序列以6~70bp為單位，以串聯(lián)形式排列，構(gòu)成數(shù)量可變的串聯(lián)重復(fù)序列等位基因常常達(dá)10個(gè)以上，信息量比RFLP大檢測(cè)技術(shù)：PCR

第五十四頁(yè)，共七十八頁(yè)。微衛(wèi)星序列(microsatellite)以2~6bp為單位(如CArepeat)，又稱短串聯(lián)重復(fù)序列(STR)。在基因組中分布廣泛，重復(fù)次數(shù)可達(dá)幾十次，具高度多態(tài)性。檢測(cè)技術(shù)：PCR第五十五頁(yè)，共七十八頁(yè)。單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepoly-morphism，SNP)第三代DNA的遺傳標(biāo)志，其多態(tài)性僅表現(xiàn)為單個(gè)核苷酸的變異。在人類基因組中的數(shù)目可達(dá)300萬(wàn)個(gè)，是一種信息量非常大的標(biāo)記系統(tǒng)。

檢測(cè)技術(shù)：DNA芯片技術(shù)第五十六頁(yè)，共七十八頁(yè)。凝血因子Ⅷ(F8)基因的主要遺傳缺陷主要為點(diǎn)突變和基因缺失 缺失 169種

插入 28種

點(diǎn)突變 347種第22號(hào)內(nèi)含子倒位:40%-50%重型HA

第五十七頁(yè)，共七十八頁(yè)。間接診斷的不確定性遺傳標(biāo)志所帶的信息有限新突變基因重組家系成員不完整第五十八頁(yè)，共七十八頁(yè)。三、基因檢測(cè)在多基因病中的應(yīng)用第五十九頁(yè)，共七十八頁(yè)。

多基因病具一定的遺傳因素，家庭發(fā)病率高于人群發(fā)病率，但是疾病的產(chǎn)生都以一定的環(huán)境條件為誘因，遺傳因素在其中所起作用程度各異。第六十頁(yè)，共七十八頁(yè)。多基因病中的遺傳因素是若干個(gè)易感基因微小作用的累加，某一易感基因結(jié)構(gòu)的變化不足以導(dǎo)致疾病的產(chǎn)生。第六十一頁(yè)，共七十八頁(yè)。

人類基因組多態(tài)性是多基因病基因診斷的基礎(chǔ)，易感基因多態(tài)性的檢測(cè)能幫助我們理解多基因病發(fā)生的機(jī)制，有助于對(duì)疾病的診斷和分類。第六十二頁(yè)，共七十八頁(yè)。高血壓候選基因多態(tài)性分析

在EH中的應(yīng)用前景

臨床分型靶器官損傷研究個(gè)體化治療第六十三頁(yè)，共七十八頁(yè)?；蚨鄳B(tài)性與鹽敏感性高血壓

-內(nèi)收素 血管緊張素轉(zhuǎn)換酶上皮鈉通道 血管緊張素原心鈉素 2腎上腺素能受體SAG蛋白亞單位3第六十四頁(yè)，共七十八頁(yè)?；蚨鄳B(tài)性與高血壓靶器官損傷腦卒中

載脂蛋白E-纖維蛋白原血管緊張素原

血管緊張素II的1型受體內(nèi)皮型一氧化氮合酶心鈉素冠心病

副氧酶凝血因子V凝血因子VII載脂蛋白B第六十五頁(yè)，共七十八頁(yè)?；蚨鄳B(tài)性檢測(cè)與個(gè)體化治療有朝一日，臨床醫(yī)師能根據(jù)病人易感基因的多態(tài)性設(shè)計(jì)有效的、個(gè)體化的治療方案，以達(dá)到最佳治療效果。第六十六頁(yè)，共七十八頁(yè)。ATG基因多態(tài)性研究目的：觀察ATG基因分型與限鈉鹽攝入及減輕體重后的血壓變化和高血壓發(fā)病率間的關(guān)系對(duì)象：1509例基因分析：ATG基因G-A多態(tài)性結(jié)果：三年后高血壓發(fā)生率（%）

對(duì)照組限鹽組減輕體重組AA型452825GG型324132

HuntSC,etal:Hypertension,1998;32:393-401第六十七頁(yè)，共七十八頁(yè)。基因多態(tài)性分析指導(dǎo)抗高血壓藥物的選擇藥物種類基因

利尿劑-內(nèi)收素

ACE抑制劑ACE、AT1-受體阻滯劑G蛋白（Gs)第六十八頁(yè)，共七十八頁(yè)。四、腫瘤相關(guān)基因檢測(cè)

在腫瘤病情監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用

第六十九頁(yè)，共七十八頁(yè)。

腫瘤是由于遺傳物質(zhì)（腫瘤相關(guān)基因）發(fā)生突變而導(dǎo)致的疾病。腫瘤相關(guān)基因的突變只是增加了個(gè)體對(duì)腫瘤的易感性而并不一定馬上產(chǎn)生腫瘤，腫瘤的發(fā)生是一個(gè)多因素、多步驟打擊的過(guò)程。第七十頁(yè)，