利用ITS序列鑒定真菌摘要：采用蘑菇提取的DNA及瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，以ITS1和ITS2為引物構(gòu)成的PCR反應(yīng)體系對(duì)目的DNA片段（ITS1區(qū)）進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后進(jìn)行分析照相，測(cè)序。隨著核糖體RdnaITS序列分析技術(shù)在菌物研究中的應(yīng)用，一些分類(lèi)地位不明確、親緣關(guān)系不清楚的物種通過(guò)該技術(shù)得到了解決，一些重要的菌物遺傳信息的到闡明。關(guān)鍵詞：ITS序列酵母菌PCR菌種鑒定1材料與方法1.1材料與試劑：真菌組織（蘑菇）、菌絲體或孢子、氯仿-異戊醇（24：1）：現(xiàn)配現(xiàn)用。70%乙醇：用95%乙醇配制，現(xiàn)配現(xiàn)用。IOxTAE溶液：IL溶液中含Trisl.2114g,EDTA29.22g,用HC1調(diào)pH至8.0。1%瓊脂糖凝膠：取lg瓊脂糖溶于lOOmllxTAE溶液中，微波爐加熱至沸騰三次，CTAB溶液、異丙醇，雙蒸水，3MNaAc,PH5.220ug/RNaseA，特異性片段PCR擴(kuò)增，ITS引物（f：ccgtaggtgaacctgcggr：tcctccgcttattgatatgc。1.2主要儀器與設(shè)備表一實(shí)驗(yàn)中使用的主要儀器儀器名稱(chēng) 型號(hào) 產(chǎn)地立式自控高壓蒸汽滅菌器LDZX-40SSI上海申安醫(yī)療器械廠(chǎng)數(shù)顯HH-4國(guó)華電器有限公司電泳儀DYY-12北京市六一儀器廠(chǎng)制冰機(jī)AF200PSC50RMSA生物安全柜HFsafe1200/C上海力申科學(xué)儀器有限公司電冰箱BCD-219D青島海爾股份有限公司Sigma咼速離心機(jī)3K30Germany電子精密天平HR-200上海精科天平酸度計(jì)DELTA302上海電子可調(diào)電爐101RF-3天津市泰斯特儀器有限公司雙層恒溫振蕩器THZ-9511K太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠(chǎng)紫外分析儀WD-9403c北京市六一儀器廠(chǎng)臺(tái)式常溫咼速離心機(jī)Centrifuge5415DGermany恒溫水浴鍋多型號(hào)Germany生化培養(yǎng)箱LRH-250上海一恒科技有限公司基因擴(kuò)增儀Palm-CyelerAustralia電泳槽DYCZ-24A北京六一儀器廠(chǎng)1.3實(shí)驗(yàn)方法：真菌基因組DNA的提?。?） CTAB溶液在65°C水浴中預(yù)熱（使用前加入1%巰基乙醇），取適量（2） 取適量蘑菇置于研缽中，加入液氮，用小杵磨制粉狀，研磨期間及時(shí)添加液氮防止高溫氧化。（3） 液氮中預(yù)冷小勺和離心管，取0.1-0.2g的研磨樣品放入1.5ml離心管中，加入700ul的CTAB溶液，輕輕攪拌搖勻，置于65C水浴中，每隔1Omin輕輕搖動(dòng)，40min后取出。（4） 室溫冷卻2min，加入等體積Tris酚/氯仿/異戊醇溶液，顛倒混勻抽提15-20分鐘。（5） 小心吸取上清液約500ml，加入等體積異丙醇顛倒混和（此刻能見(jiàn)到DNA絮狀物）（6） lOOOOrpm,離心10min,倒掉液體，留下沉淀。（7） 加入1ml70%的乙醇洗滌DNA沉淀，lOOOOrpm,離心5min,倒掉液體，干燥DNA（超凈臺(tái)風(fēng)干或自然風(fēng)干）（8） 沉淀風(fēng)干透亮后50ulTE緩沖液，使DNA溶解，置于-20c保存。真菌基因組DNA的檢測(cè)：⑴制備瓊脂糖凝膠：將10XTAE貯存液用蒸餾水稀釋成1XTAE電泳緩沖液，待用，按1%稱(chēng)取適量瓊脂糖，置于250ml錐形瓶中，加入對(duì)應(yīng)量1XTAE稀釋緩沖液，蓋上封口膜，以減少水份蒸發(fā)，放入微波爐里加熱沸騰，取出搖勻，使瓶壁上粘附的瓊脂糖全部溶解，反復(fù)3次，至瓊脂糖全部熔化，放置，待其稍冷卻。⑵膠板的制備：將制膠槽置于水平支持物上，選擇合適厚度和齒數(shù)的樣品梳，插上梳子。向冷卻至50-60C的瓊脂糖膠液中加入溴化乙錠（EB）溶液數(shù)滴，搖勻，小心地倒入制膠槽內(nèi)，使膠液形成均勻的膠層。待膠完全凝固后，小心撥出梳子，將膠塊取出，置于已加入足量1XTAE電泳緩沖液得電泳槽內(nèi)。⑶加樣：取20卩l(xiāng)DNA樣品與2卩l(xiāng)6X加樣緩沖液混勻,用微量移液槍小心加入樣品槽中，在第一個(gè)上樣孔或最后一個(gè)上樣孔內(nèi)加入5ul的100bpDNAladder。⑷電泳：接通電泳槽與電泳儀的電源，以5V/cm（約100V）電泳，當(dāng)溴酚藍(lán)染料移動(dòng)到距凝膠前沿1-2cm處，停止電泳。⑸成像：戴上一次性手套，在波長(zhǎng)為254nm的長(zhǎng)波長(zhǎng)紫外燈下觀(guān)察膠塊，DNA存在處顯示出肉眼可辨的桔紅色熒光條帶，用凝膠成像系統(tǒng)照相。PCR擴(kuò)增：ITS引物(F:CCGTAGGTGAACCTGCGG,R:TCCTCCGCTTATTGATATG)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)，采用瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)檢測(cè)同上。ITS片段的測(cè)序：將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物郵寄至測(cè)序公司，由測(cè)序公司完成測(cè)序。BLAST比對(duì)、鑒定屬、種：登錄NCBI主頁(yè)-點(diǎn)擊BLAST-點(diǎn)擊Nucleotide-nucleotideBLAST在Search文本框中粘貼檢測(cè)序列-點(diǎn)擊BLAST-點(diǎn)擊Format-得到resultofBLAST。圖片不是很清晰，由于在處理過(guò)程中沒(méi)有及時(shí)記下順序，所以對(duì)于上圖就無(wú)法清楚準(zhǔn)確的進(jìn)行分析，這是一個(gè)失誤。圖片中能見(jiàn)到有一條條亮的是“Mark”共有1200、900、700、500、300、150、100、50bp等8類(lèi)DNA片段，根據(jù)原圖對(duì)比，本次實(shí)驗(yàn)只可以檢測(cè)到1200、900、700、500、300、100bp等6類(lèi)DNA片段。圖片中基因組DNA破損片段較小。2.2ITS測(cè)序結(jié)果TCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAATGAATTCACTATGGAGTTGTTGCTGGCCTCTAGGGGCATGTGCACGCTTCACTAGTCTTTCAACCACCTGTGAACTTTTGATAGATYTGTGAAGTCGTCTTTCAAGTCGTCAGACTTGGTTTGCTGGGATTTAAACGTCTCGGTGTGACAACGCAGTCTATTTACTTAACACACCCCAAATGTATGTCTACGAATGTCATTTAATGGRCCTTGTGCCTATAAACCATAATACAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCGCCCCTTGGTATTCCGAGGGGCATGCCTGTTTGAGTGTCATTAAATTCTCAAACTCACTTTGGTTTTTTCCAATTGTGATGTTTGGATTGTTGGGGGCTGCTGGCCTTGACAGGTCGGCTCCTCTTAAATGCATTAGCAGGACTTCTCATTGCCTCTGCGCATGATGTGATAATTATCACTCATCAATAGCACGCATGAATAGAGTCCAGCTCTCTAATCGTCCGCAAGGACAATTTGACAATTTGACCTCAAATCAGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGA3討論由圖一可知，所提取出來(lái)的基因組DNA片段比較小，具體原因可能如下：在DNA提取步驟中，時(shí)間可能過(guò)長(zhǎng)，是DNA斷裂較為厲害；在用氯仿異戊醇抽提蛋白質(zhì)時(shí)，要?jiǎng)×覔u動(dòng)10min,這樣的步驟也許會(huì)使DNA斷裂；再者，使用高速離心機(jī)，其轉(zhuǎn)速達(dá)到lOOOOrpm,也可以使DNA斷裂。Mark理論條帶為8條，實(shí)際只有6條，可能原因?yàn)镸ark量太少，上樣時(shí)只用了