實(shí)驗(yàn)一、常用培養(yǎng)基的制備、滅菌與消毒營(yíng)養(yǎng)：從外部環(huán)境攝取其生命活動(dòng)所必需的能量和物質(zhì)，滿足生長(zhǎng)和繁殖需要的一種生理過(guò)程。是生命活動(dòng)的物質(zhì)基礎(chǔ)，是生命活動(dòng)的起點(diǎn)。營(yíng)養(yǎng)物：具有營(yíng)養(yǎng)功能的物質(zhì)。也包括光能。提供生物的結(jié)構(gòu)物質(zhì)、能量、代謝調(diào)節(jié)物質(zhì)和良好的生理環(huán)境。營(yíng)養(yǎng)要素：碳源、氮源、能源、生長(zhǎng)因子、無(wú)機(jī)鹽和水培養(yǎng)基：人工配制、適合微生物生長(zhǎng)繁殖或產(chǎn)生代謝產(chǎn)物的混合養(yǎng)料。要求：應(yīng)具備6大營(yíng)養(yǎng)要素；物質(zhì)比例合適；必須滅菌。選用和設(shè)計(jì)培養(yǎng)基的原則、方法及制備過(guò)程：原則：目的明確、營(yíng)養(yǎng)協(xié)調(diào)、經(jīng)濟(jì)節(jié)約物理化學(xué)條件適宜方法：生態(tài)模擬、查閱文獻(xiàn)精心設(shè)計(jì)、試驗(yàn)比較

步驟：稱量、熔化、調(diào)PH、過(guò)濾、分裝、加塞、包扎、滅菌、冷卻、無(wú)菌檢查

培養(yǎng)基種類：一、按成分的不同分天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基、半合成培養(yǎng)基二、按培養(yǎng)基的物理狀態(tài)分固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基三、按培養(yǎng)基用途基礎(chǔ)培養(yǎng)基、選擇培養(yǎng)基加富培養(yǎng)基、鑒別培養(yǎng)基加熱法：干熱法：火焰灼燒滅菌和熱空氣滅菌。1、火焰灼燒適用于接種環(huán)、接種針和金屬用具如鑷子等，試管口和瓶口，涂布用玻璃棒。2、熱空氣滅菌利用高溫干燥空氣（160－170C）加熱滅菌1－2h，適用于玻璃器皿和培養(yǎng)皿等。原理加熱使蛋白質(zhì)變性，與水的含量有關(guān)，當(dāng)環(huán)境和細(xì)胞含水量越大，凝固越快。3、注意事項(xiàng)：

1）培養(yǎng)基、橡膠制品、塑料制品不能用此法；

2）溫度控制在<180°；

3）物品不能太擠；

4）溫度降至70°時(shí)才開(kāi)箱門(mén)。

濕熱法：原理：因?yàn)闈駸嶂芯w吸水，蛋白質(zhì)容易凝固，因蛋白質(zhì)含水量增加，所需凝固溫度降低；濕熱的蒸氣有潛熱存在。所以效果比同溫度下干熱好。

高壓蒸汽滅菌法：1、設(shè)備：高壓滅菌鍋2、時(shí)間長(zhǎng)短根據(jù)滅菌物品的種類和數(shù)量不同有所變化。3、適用于培養(yǎng)基、工作服、橡膠物品等的滅菌，也可用于玻璃器皿的滅菌。4、注意事項(xiàng)：

1）冷空氣徹底排除；2）加水；3）壓力降為“0”時(shí)方可打開(kāi)。

常壓蒸汽滅菌：

對(duì)于不宜用高壓蒸汽滅菌的培養(yǎng)基如明膠培養(yǎng)基、牛乳培養(yǎng)基，含糖培養(yǎng)基等可采用此法。徹底滅菌則采用間歇滅菌方法。

煮沸滅菌法：適用注射器和解剖器皿，時(shí)間10－15min，

超高溫殺菌

135-150°C和2-8s對(duì)牛乳和其它液態(tài)食品。優(yōu)點(diǎn)：保持食品價(jià)值和營(yíng)養(yǎng)成分。輻射滅菌：原理：紫外線波長(zhǎng)在200－300nm，具有殺菌作用，以265-266殺菌力強(qiáng)。此段波長(zhǎng)易被細(xì)胞中核酸吸收；可產(chǎn)生臭氧和過(guò)氧化氫。殺菌效力與強(qiáng)度和時(shí)間的乘積成正比。缺點(diǎn)：穿透力不大。距照射物<1.2m為宜。應(yīng)用：無(wú)菌室，醫(yī)院。注意事項(xiàng)：對(duì)眼睛和皮膚有刺激作用。射線滅菌：r射線，穿透力強(qiáng)，適用于堆積物品的滅菌。

化學(xué)藥品滅菌：原理：應(yīng)用化學(xué)制劑破壞細(xì)菌代謝機(jī)能。殺菌劑如重金屬離子；抑菌劑如磺胺類及多數(shù)抗生素。注意：與藥品的濃度高低，時(shí)間長(zhǎng)短，微生物種類以及微生物所處的環(huán)境有關(guān)。常用化學(xué)殺菌劑有：乙醇、醋酸、石碳酸福爾馬林、升汞、高錳酸鉀、新潔爾滅等實(shí)驗(yàn)二、微生物的分離、純化及培養(yǎng)技術(shù)分離與純化：從混雜的微生物群體中獲得只含某一種或某一株微生物的過(guò)程。為什么要進(jìn)行純培養(yǎng)：平板上的單一菌落并不一定保證是一種菌。

常用的分離、純化方法：?jiǎn)渭?xì)胞挑取法稀釋涂布平板法

稀釋混合平板法平板劃線法

平板劃線法：1、倒平板，標(biāo)記培養(yǎng)基名稱，編號(hào)和實(shí)驗(yàn)日期。2、劃線方法

稀釋混合平板法：1、先加菌2、倒平板時(shí)注意培養(yǎng)基溫度3、混合均勻微生物培養(yǎng)技術(shù)1、斜面接種2、液體培養(yǎng)基接種3、穿刺接種4、將已接種的斜面、半固體和液體培養(yǎng)基放置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5、將生長(zhǎng)好的菌種用牛皮紙包好，置4℃冰箱中保存。3、懸液法將細(xì)菌、酵母菌細(xì)胞懸浮在一定的溶液中保存。溶液包括蒸餾水、糖溶液、磷酸緩沖液、食鹽水等。4、冷凍法使菌種始終存放在低溫環(huán)境下的保藏方法。包括低溫法和液氮法。此法關(guān)鍵是要克服細(xì)胞的冷凍損傷。注意控制降溫速率及保護(hù)劑的使用。5、真空干燥法這類方法包括冷凍真空干燥法和L－干燥法。冷凍真空干燥法是將要保藏的微生物樣品先經(jīng)低溫預(yù)凍，然后在低溫狀態(tài)下進(jìn)行減壓干燥。L-干燥法則不需要低溫預(yù)凍樣品，只是使樣品維持在10－20C?范圍內(nèi)進(jìn)行真空干燥。操作方法1、斜面保藏法將菌種轉(zhuǎn)接在適宜固體斜面培養(yǎng)基上，待其充分生長(zhǎng)后，用牛皮紙將棉塞部分包扎好（棉塞換成膠塞效果更好），置4C?冰箱中包藏。保藏時(shí)間依微生物的種類而定。霉菌、放線菌及芽孢菌保存2－4個(gè)月移種一次，酵母菌間隔兩個(gè)月，普通細(xì)菌一個(gè)月，假單胞菌兩周傳代一次。此法優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單、使用方便，缺點(diǎn)是保藏時(shí)間短、易被污染。2、液體石蠟保藏法將無(wú)菌石蠟加在已長(zhǎng)好菌的斜面上，其用量以高出斜面頂端1CM為準(zhǔn)，使菌種與空氣隔絕。將試管直立，置低溫或室溫下保存。此法實(shí)用且效果較好。霉菌、放線菌、芽孢菌可保藏兩年以上，酵母菌可保藏1－2年，普通細(xì)菌也可保藏1年左右。3、穿刺保藏法按穿刺接種方式培養(yǎng)菌種，菌種長(zhǎng)好后用膠塞封嚴(yán)，置4℃冰箱存放。(4)無(wú)菌檢查 每10支砂土管隨機(jī)抽1支，將砂土倒入肉湯培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)40h，若發(fā)現(xiàn)有微生物生長(zhǎng)，所有砂土管則需重新滅菌，再作無(wú)菌試驗(yàn)，直至證明無(wú)菌后方可使用。(5)菌懸液的制備 取生長(zhǎng)健壯的新鮮斜面菌種，加入2-3ml無(wú)菌水(每18x180mm的試管斜面菌種)，用接種環(huán)輕輕將菌苔洗下，制成菌懸液。(6)分裝樣品 每支砂土管(注明標(biāo)記后)加入0．5ml菌懸液(剛剛使砂土潤(rùn)濕為宜)，用接種針拌勻。(7)干燥將裝有菌懸液的砂土管放入干燥器內(nèi)，干燥器底部盛有干燥劑。用真空泵抽干水分后火焰封口(也可用橡皮塞或棉塞塞住試管口)。(8)保存置4℃冰箱或室溫干燥處，每隔一定的時(shí)間進(jìn)行檢測(cè)。此法多用于產(chǎn)芽孢的細(xì)菌、產(chǎn)生孢子的霉菌和放線菌。在抗生素工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用廣泛、效果較好，可保存幾年時(shí)間，但對(duì)營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞效果不佳。5、冷凍真空干燥法（1）凍干管的準(zhǔn)備：中性硬制玻璃，烘干，滅菌。（2）菌種培養(yǎng)：細(xì)菌芽孢脫落；放，霉孢子豐滿。（3）保護(hù)劑的配制：配制，滅菌，檢查（4）菌懸液的制備：2-3ml保護(hù)劑（5）分裝樣品：菌懸液每管0.2ml（6）預(yù)凍：程序控溫儀降溫（7）冷凍真空干燥：-50℃下抽真空（8）取出樣品：輕敲松散即達(dá)標(biāo)（9）第二次干燥：（10）熔封（11）存活性檢測(cè)：抽取一管進(jìn)行存活性檢查（12）保存：4℃保存實(shí)驗(yàn)三－1、細(xì)菌的形態(tài)和結(jié)構(gòu)觀察（簡(jiǎn)單染色）一、目的要求觀察細(xì)菌的菌落特征掌握簡(jiǎn)單染色法在油鏡下觀察細(xì)菌個(gè)體的形態(tài)學(xué)習(xí)環(huán)境中微生物的檢查方法，并加深對(duì)微生物分布廣泛性的認(rèn)識(shí)簡(jiǎn)單染色法原理細(xì)菌在中性的環(huán)境中帶負(fù)電荷，用堿性染料（解離時(shí)帶正電荷）如美蘭、結(jié)晶紫等進(jìn)行染色。實(shí)驗(yàn)三－2：放線菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察一、目的要求掌握放線菌形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察的方法觀察放線菌的菌落特征、個(gè)體形態(tài)及其繁殖方式。二、原理放線菌菌落在培養(yǎng)基上著生牢固，與基質(zhì)結(jié)合緊密，難以用接種針挑取。放線菌細(xì)胞一般呈分枝無(wú)隔的絲狀，菌絲體分為在培養(yǎng)基內(nèi)部的基內(nèi)菌絲和伸出培養(yǎng)基表面的氣生菌絲。氣生菌絲上部分化成孢子絲，呈螺旋狀、波浪狀或分枝狀。菌絲呈各種顏色，有的能分泌水溶性色素到培養(yǎng)基內(nèi)。孢子絲長(zhǎng)出孢子，孢子形狀各異。由