B41DB15內(nèi) 蒙 古 自 治 區(qū) 地 方 標(biāo) 準(zhǔn)DB15/XXXXX—XXXX動物墊料中志賀氏菌檢測方法MethodfordetectingShigellainanimalbedding點(diǎn)擊此處添加與國際標(biāo)準(zhǔn)一致性程度的標(biāo)識（征求意見稿）XXXX-XX-XX發(fā)布 XXXX-XX-XX實(shí)施內(nèi)蒙古自治區(qū)市場監(jiān)督管理局 發(fā)布DB15/TXXXXX—XXXX前 言本標(biāo)準(zhǔn)按照 GB/T1.1-2009 給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由中華人民共和國呼和浩特海關(guān)提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：中華人民共和國呼和浩特海關(guān)、內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：趙治國、延涵、盛萬里、王海艷、陳林軍、崔強(qiáng)、敖威華、李軍燕、羅曉平、韓祎陟。IDBXX/XXXXX—XXXX動物墊料中志賀氏菌檢測范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了動物墊料中志賀氏菌的分離鑒定定性檢測方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于動物墊料中志賀氏菌定性檢測。規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682 分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB19489 實(shí)驗(yàn)室 生物安全通用要求GB/T33682 基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜鑒別微生物方法通則SN/T1538.1 培養(yǎng)基制備指南 第1部分：實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)基制備質(zhì)量保證通則SN/T1538.2 培養(yǎng)基制備指南 第2部分：培養(yǎng)基性能測試實(shí)用指南3 術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1動物墊料 animalbedding用于吸收動物排泄物，使動物保持舒適生活環(huán)境的鋪墊物。包括動物籠內(nèi)非直接與動物機(jī)體接觸的鋪墊物。設(shè)備和材料4.1 冰箱：2℃～5℃。4.2 恒溫培養(yǎng)箱： 36℃±1℃。4.3 厭氧培養(yǎng)裝置 41.5 ℃±1℃。4.4 均質(zhì)器。4.5 漩渦振蕩器。4.6 電子天平：感量 0.1g，0.0001g。4.7 顯微鏡：10×～100×4.8 全自動微生物生化鑒定系統(tǒng)。4.9 飛行時(shí)間質(zhì)譜儀。4.10 二級生物安全柜。4.11 無菌吸管：1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)或微量移液器及吸頭。4.12 無菌濾膜均質(zhì)袋。4.13 PH計(jì)。4.14 無菌培養(yǎng)皿： 15mm×90mm。4.15 無菌試管：18mm×180mm。1DBXX/XXXXX—XXXX4.16 無菌鑷子。4.17 無菌剪刀。4.18 無菌勺。4.19 無菌玻片。4.20 無菌棉簽。培養(yǎng)基和試劑5.1 志賀氏菌增菌肉湯 -新生霉素：見附錄 A.2。5.2 麥康凱（MAC）瓊脂：見附錄 A.3。5.3 木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽（ XLD）瓊脂：見附錄 A.4。5.4 志賀氏菌顯色培養(yǎng)基。5.5 三鐵塘（TSI）瓊脂：見附錄 A.5。5.6 營養(yǎng)瓊脂：見附錄 A.6。5.7 半固體瓊脂：見附錄 A.7。5.8 葡萄糖胺培養(yǎng)基：見附錄 A.8。5.9 尿素瓊脂：見附錄 A.9。5.10 β-半乳糖苷酶培養(yǎng)基：見附錄 A.10。5.11 氨基酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基：見附錄 A.11。5.12 糖發(fā)酵管：見附錄 A.12。5.13 西蒙氏檸檬酸鹽培養(yǎng)基：見附錄 A.13。5.14 粘液酸鹽培養(yǎng)基：見附錄 A.14。5.15 蛋白胨水、靛基質(zhì)試劑：見附錄 A.15。5.16 志賀氏菌生化鑒定試劑盒。檢驗(yàn)程序志賀氏菌檢驗(yàn)程序見圖1。圖1志賀氏菌檢驗(yàn)程序2DBXX/XXXXX—XXXX操作步驟7.1 采樣 采樣原則樣品采集應(yīng)遵循隨機(jī)性、代表性的原則。采樣過程遵循無菌操作程序，防止一切可能的外來污染。 顆粒狀或粉末墊料樣品對送檢樣品包裝內(nèi)不同部位樣品進(jìn)行隨機(jī)多點(diǎn)取樣至少 250g，充分混勻后稱取 25g顆粒狀或粉末狀墊料樣品，加入 225mL志賀氏菌增菌肉湯，充分振搖或均質(zhì) 1min～2min，于41.5 ℃±1℃，厭氧培養(yǎng) 16h～20h。 平面墊料樣品無菌操作將滅菌規(guī)格板（ 5cm 5cm）放在平面墊料表面，用浸有無菌稀釋液（磷酸緩沖液或生理鹽水）的棉拭子，在規(guī)格板內(nèi)來回均勻涂抹整個(gè)方格3次，并隨之轉(zhuǎn)動棉拭子，然后用滅菌剪刀剪去棉拭子與手接觸的部分，將棉拭子頭置入裝有25mL無菌稀釋液的無菌錐形瓶中，根據(jù)樣品面積大小重復(fù)取樣1～4個(gè)規(guī)格板面積，相應(yīng)地將棉拭子頭置入25mL～100mL的無菌稀釋液中，充分振搖制成樣品原液（1mL原液對應(yīng)的樣品面積為1cm2）。取25mL樣品原液加入225mL志賀氏菌增菌肉湯，充分振搖或均質(zhì)1min～2min。于41.5℃±1℃，厭氧培養(yǎng)16h～20h。表1不同面積平面類墊料樣品采樣量樣品面積采樣量m2cm2規(guī)格板數(shù)小于0.25（含）2510.25～0.5（含）5020.5～0.75（含）753大于0.7510047.2 分離取增菌后的志賀氏菌增菌肉湯分別劃線接種于 XLD瓊脂平板和MAC瓊脂平板或志賀氏菌顯色培養(yǎng)基平板上，于 36℃±1℃培養(yǎng)20h～24h，觀察各個(gè)平板上生長的菌落形態(tài)。宋內(nèi)氏志賀氏菌的單個(gè)菌落直徑大于其他志賀氏菌。若出現(xiàn)的菌落不典型或菌落較小不易觀察，則繼續(xù)培養(yǎng)至 48h在進(jìn)行觀察。志賀氏菌在不同選擇性瓊