ICS11.220F41NY中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標準NY/T549-2002赤羽病細胞微量中和試驗方法Cellsmicroneutralizationtestforakabanedisease2002-08-27發(fā)布2002-12-01實施中華人民共和國農(nóng)業(yè)部發(fā)布

NY/T549-2002印赤羽?。╝kabanedisease,又名阿卡斑?。┦怯沙嘤鸩〔《荆╝kabanediseasevirus）引起的牛、綿羊和山羊的一種多型性傳染病。該病以流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎、晴形產(chǎn)為特征，能引起先天性關(guān)節(jié)彎曲和積水性無腦癥。本病的病原是赤羽病病毒，屬布尼病毒科布尼病毒屬，病毒表面有兩種糖蛋白(G1和G),它們分別誘導(dǎo)中和抗體和血凝抑制抗體產(chǎn)生。本病的血清學診斷方法為細胞微量中和試驗本標準由農(nóng)業(yè)部畜牧獸醫(yī)局提出。本標準由全國動物檢疫標準化技術(shù)委員會歸口本標準起草單位：農(nóng)業(yè)部動物檢疫所。本標準主要起草人：周立橋、李昌琳、封啟民、李其平。

NY/T549-2002赤羽病細胞微量中和試驗方法1范圍本標準規(guī)定了赤羽病(akabanedisease)細胞微量中和試驗技術(shù)要求。本標準適用于牛、羊赤羽病感染的定性以及免疫群體抗體水平的評估.材料準備2.16孔細胞培養(yǎng)物,移液器(50pL.、200%L)滴頭，尤毒透明塑料膠帶，小試管，2.2Vero細胞或SVP細胞：2.3抗原、標準陽性血清、標準陰性血清。2.4被檢血清，無菌采集·不加防腐劑。3操作方法3.1準備3.1.1取一支已知滴度的赤羽病病毒(AKV）用199細胞培養(yǎng)液稀釋成100TCID./50PL，作為工作濃度抗原。3.1.2被檢血清、標準陽性血消、標準陰性血清均56（滅活30min,用199液做1：4稀釋(即50l.血消加人15041.199液中）3.1.3按常規(guī)微量中和試驗法每個樣品接種4孔，每孔分別加被檢稀釋血清和工作濃度抗原各50L..輕輕振藝培養(yǎng)板使抗質(zhì)與稀釋血清充分混合·將培養(yǎng)板加蓋貿(mào)37C培養(yǎng)箱內(nèi)中和1h.3.1.4每孔滴加SVP細胞或Vero細胞懸液(20萬/ml.)100L,用透明塑料膠帶封板，置37C溫箱內(nèi)培養(yǎng).用倒暨顯微鏡觀察細胞病變情況(通常72h內(nèi)引起細胞病變)。3.2對照設(shè)置每次試驗均要設(shè)暨標準陽性、陰性血清對照、病毒對照、正常細胞對照和抗原實際用量的回歸滴度對照。3.2.1標準陽性、陰性血清對照，將已稀釋好的標準陽性、陰性血清分別加人培養(yǎng)板4孔內(nèi)，每孔50PI.，然后各孔加入工作濃度抗原50PL。3.2.2病毒對照：將工作濃度抗原滴加培養(yǎng)板4孔內(nèi)，每孔50“L,補加細胞生長液50L。3.2.3將以上三種對照置37℃溫箱內(nèi)1h.然后于各孔內(nèi)加人100L細胞懸液，置37℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)，72h后在倒置顯微鏡下觀察結(jié)果。3.2.4正常細胞對照：于培養(yǎng)板4孔內(nèi)各加100PL細胞懸液，然后再于各孔補加細胞生長液100L.3.2.5抗原實際用量的回歸滴度的測定：在每次試驗中，應(yīng)對使用的100TCIDa/50I.抗原進行實際用量的測定，將工作濃度抗原作10倍遞增稀釋到10-,每個稀釋度接種4孔，每孔50L，立即補加細胞生長液50L,置37C溫箱內(nèi)1h,然后每孔加入100L細胞懸液,計算該