第十章化學發(fā)光免疫分析技術(shù)發(fā)光免疫分析:是將發(fā)光分析和免疫反應(yīng)相結(jié)合而建立起來的一種新的檢測微量抗原或抗體的新型標記免疫分析技術(shù)。

第一節(jié)概述

發(fā)光:是指分子或原子中的電子吸收能量后，由基態(tài)（較低能級）躍遷到激發(fā)態(tài)（較高能級），然后再返回到基態(tài)，并釋放光子的過程。根據(jù)形成激發(fā)態(tài)分子的能量來源不同可分為:光照發(fā)光、生物發(fā)光、化學發(fā)光等。

光照發(fā)光（photoluminescence）是指發(fā)光劑（熒光素）經(jīng)短波長的入射光照射后，電子吸收能量躍遷到激發(fā)態(tài)，在其回復(fù)至基態(tài)時，發(fā)射出較長波長的可見光（熒光）。

生物發(fā)光（bioluminescence）是指發(fā)生在生物體內(nèi)的發(fā)光現(xiàn)象，如螢火蟲的發(fā)光，反應(yīng)底物為螢火蟲熒光素，在熒光素酶的催化下，利用ATP能，生成激發(fā)態(tài)氧化型熒光素，它在回復(fù)基態(tài)時多余的能量以光子的形式釋放出來。

化學發(fā)光（chemiluminescence）是指伴隨化學反應(yīng)過程所產(chǎn)生的光的發(fā)射現(xiàn)象。某些物質(zhì)(發(fā)光劑)在化學反應(yīng)時，吸收了反應(yīng)過程中所產(chǎn)生的化學能，使反應(yīng)的產(chǎn)物分子或反應(yīng)的中間態(tài)分子中的電子躍遷到激發(fā)態(tài)，當電子從激發(fā)態(tài)回復(fù)到基態(tài)時，以發(fā)射光子的形式釋放出能量，這一現(xiàn)象稱為化學發(fā)光。一、化學發(fā)光

一些化學反應(yīng)能釋放足夠的能量把參加反應(yīng)的物質(zhì)激發(fā)到能發(fā)射光的電子激發(fā)態(tài)，若被激發(fā)的是一個反應(yīng)產(chǎn)物分子，則這種反應(yīng)過程叫直接化學發(fā)光。反應(yīng)過程可簡單地描述如下：

A十BC*C*C＋h·γ其中γ為光子，C*表示C處于單線激發(fā)態(tài)。

若激發(fā)能傳遞到另一個未參加化學反應(yīng)的分子D上，使D分子激發(fā)到電子激發(fā)態(tài)，D分子從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時發(fā)光，這種過程叫間接化學發(fā)光。反應(yīng)過程可表示如下：

A十BC*C*十DC十D*D*D十h·γ化學發(fā)光效率（φCL）決定于生成激發(fā)態(tài)產(chǎn)物分子的化學激發(fā)效率（φCE）和激發(fā)態(tài)分子的發(fā)射效率（φEM）?；瘜W發(fā)光反應(yīng)的發(fā)光效率、光輻射的能量大小以及光譜范圍，完全由發(fā)光物質(zhì)的性質(zhì)所決定，每一個發(fā)光反應(yīng)都具有其特征性的化學發(fā)光光譜和不同的化學發(fā)光效率。二、化學發(fā)光效率化學發(fā)光免疫分析目前分類按發(fā)光劑不同分為

1.發(fā)光酶免疫測定技術(shù)（CLEIA）

2.化學發(fā)光免疫測定技術(shù)(CLIA)

3.電化學發(fā)光免疫測定技術(shù)(ECLIA)第二節(jié)化學發(fā)光劑和標記技術(shù)在化學發(fā)光反應(yīng)中參與能量轉(zhuǎn)移并最終以發(fā)射光子的形式釋放能量的化合物，稱為化學發(fā)光劑或發(fā)光底物。

一、化學發(fā)光劑能作為化學發(fā)光劑的條件：①發(fā)光的量子產(chǎn)率高；②它的物理-化學特性要與被標記或測定的物質(zhì)相匹配；③能與抗原或抗體形成穩(wěn)定的偶聯(lián)結(jié)合物；④其化學發(fā)光常是氧化反應(yīng)的結(jié)果；⑤在所使用的濃度范圍內(nèi)對生物體沒有毒性。

㈠直接化學發(fā)光劑

直接化學發(fā)光劑在發(fā)光免疫分析過程中不需酶的催化作用，直接參與發(fā)光反應(yīng)，它們在化學結(jié)構(gòu)上有產(chǎn)生發(fā)光的特有基團，可直接標記抗原或抗體。

1.

吖啶酯在堿性條件下被H2O2氧化時,發(fā)出波長為470nm的光，具有很高的發(fā)光效率，其激發(fā)態(tài)產(chǎn)物N-甲基吖啶酮是該發(fā)光反應(yīng)體系的發(fā)光體。

2．三聯(lián)吡啶釕

三聯(lián)吡啶釕[RU(bpy)3]2+是電化學發(fā)光劑，它和電子供體三丙胺（TPA）在陽電極表面可同時失去一個電子而發(fā)生氧化反應(yīng)。三聯(lián)吡啶釕電化學發(fā)光劑反應(yīng)原理

㈡酶促反應(yīng)發(fā)光劑：是利用標記酶的催化作用，使發(fā)光劑（底物）發(fā)光，這一類需酶催化后發(fā)光的發(fā)光劑稱為酶促反應(yīng)發(fā)光劑。

1．魯米諾及其衍生物

2．AMPPD1．魯米諾魯米諾發(fā)光原理魯米諾增強發(fā)光反應(yīng)原理2．AMPPD〔3-(2‘-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4-(3“-磷酰氧基)苯-1,2-二氧雜環(huán)丁烷〕〕1.碳二亞胺（EDC）縮合法

二、發(fā)光劑的標記技術(shù)C--O2.過碘酸鈉氧化法

3．重氮鹽偶聯(lián)法4.N-羥基琥珀酰亞胺活化法

1．發(fā)光劑的選擇

2．被標記蛋白質(zhì)的性質(zhì)

3．標記方法的選擇

4．原料比

5．標記率

6．溫度

7．純化與保存影響標記的因素第三節(jié)化學發(fā)光免疫分析的類型

用吖啶酯直接標記抗體(抗原)，與待測標本中相應(yīng)的抗原(抗體)發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成固相包被抗體-待測抗原-吖啶酯標記抗體復(fù)合物，這時只需加入氧化劑（H2O2）和NaOH使成堿性環(huán)境，吖啶酯在不需要催化劑的情況下分解、發(fā)光。由集光器和光電倍增管接收、記錄單位時間內(nèi)所產(chǎn)生的光子能，這部分光的積分與待測抗原的量成正比，可從標準曲線上計算出待測抗原的含量。一、直接化學發(fā)光免疫分析發(fā)光YYY磁微粒被測抗原+抗體+帶丫啶酯標記物抗體YYYYYYYYYYY沖洗后---夾心法（1）加入H2O2（pH<10）（2）加入堿（pH>10）直接化學發(fā)光的機理磁微粒模式圖YYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYY特點抗原和抗體結(jié)合與未結(jié)合部分的易分離磁微粒技術(shù)化學發(fā)光酶免疫分析（chemiluminescenceenzyme

immunoassay，CLEIA）是用參與催化某一化學發(fā)光反應(yīng)的酶如辣根過氧化物酶（HRP）或堿性磷酸酶(ALP)來標記抗原或抗體，在與待測標本中相應(yīng)的抗原(抗體)發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成固相包被抗體-待測抗原-酶標記抗體復(fù)合物，經(jīng)洗滌后，加入底物(發(fā)光劑)，酶催化和分解底物發(fā)光，由光量子閱讀系統(tǒng)接收，光電倍增管將光信號轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘柌⒓右苑糯?，再把它們傳送至計算機數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，計算出測定物的濃度。二、化學發(fā)光酶免疫分析該分析系統(tǒng)采用辣根過氧化物酶（HRP）標記抗體(或抗原)，在與反應(yīng)體系中的待測標本和固相載體發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成固相包被抗體-待測抗原-酶（HRP）標記抗體復(fù)合物，這時加入魯米諾發(fā)光劑、H2O2和化學發(fā)光增強劑使產(chǎn)生化學發(fā)光。㈠辣根過氧化物酶標記的化學發(fā)光免疫分析辣根過氧化物酶標記化學發(fā)光免疫分析示意圖

該分析系統(tǒng)以堿性磷酸酶標記抗體(或抗原)，在與反應(yīng)體系中的待測標本和固相載體發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成固相包被抗體-待測抗原-酶標記抗體復(fù)合物，這時加入AMPPD發(fā)光劑，堿性磷酸酶使AMPPD脫去磷酸根基團而發(fā)光。

㈡堿性磷酸酶標記的化學發(fā)光免疫分析堿性磷酸酶標記化學發(fā)光免疫分析示意圖

分析步驟分配樣品,磁顆粒和試劑孵育使反應(yīng)物結(jié)合在磁場中清洗去除未結(jié)合物質(zhì)加入底物產(chǎn)生信號孵育,促使信號的產(chǎn)生信號檢測電化學發(fā)光免疫分析（electrochemiluminescenceimmunoassay，

ECLIA）是以電化學發(fā)光劑三聯(lián)吡啶釕標記抗體(抗原)，以三丙胺(TPA)為電子供體，在電場中因電子轉(zhuǎn)移而發(fā)生特異性化學發(fā)光反應(yīng)，它包括電化學和化學發(fā)光兩個過程。

三、電化學發(fā)光免疫分析電化學指在陽極表面[Ru(bpy)3]2+

和TPA同時失去電子發(fā)生氧化反應(yīng)。自由基TPA+●失去一個質(zhì)子（H+），成為自由基TPA●，這是一個強還原劑。TPA●

將一個電子遞給Ru(bpy)33+，而TPA被氧化。激發(fā)態(tài)的Ru(bpy)32+*在衰減時發(fā)射一個波長為620nm的光子?；瘜W發(fā)光包括電化學發(fā)光免疫分析示意圖磁性微粒直徑2.8μm，表面的凸凹使包被面積放大。磁性微粒體積小，懸浮于反應(yīng)體系中，形成均一穩(wěn)定的液相，在磁場中易于分離。電化學發(fā)光免疫測定示意圖電化學發(fā)光免疫測定示意圖標記磁顆粒在電場中發(fā)光工作示意圖ECLIA體系結(jié)構(gòu)圖ECLIA檢測流程圖一（雙抗體夾心的形成）ECLIA檢測流程圖二（生物素與親和素結(jié)合）ECLIA檢測流程圖三（磁珠吸引吸附于電極表面）ECLIA檢測流程圖四（電極充電啟動電化學反應(yīng)）ECLIA檢測