第三章

遺傳的物質基礎第一節(jié)遺傳物質的本質一、DNA是遺傳物質（一）DNA是遺傳物質的證明1928年Griffith等進行的肺炎球菌轉化（transformation）實驗.1944年Avery證明DNA是遺傳物質.二、RNA也可作為遺傳物質（一）RNA病毒病毒顆粒（viron）：由病毒RNA基因組和包被在外的蛋白質外殼組成.病毒的生存方式：病毒編碼包裝基因組所需的蛋白，以及一些在感染循環(huán)中復制病毒所需的蛋白質。其他蛋白質由宿主提供。因此病毒不能獨立生存。（二）類病毒（viroid）類病毒:是使高等植物產生疾病的有傳染性的因子，由很小的環(huán)狀RNA分子構成。與病毒不同，類病毒的RNA本身就是感染因子。類病毒只由RNA組成，其中廣泛存在不完全的堿基配對，形成一種特有的棒狀結構。類病毒的基因組不能編碼蛋白質。類病毒的復制：必須由宿主的酶來完成，其RNA作為模板。類病毒對宿主的影響：類病毒可通過復制占有宿主細胞中關鍵的酶，從而影響宿主細胞的正常功能；類病毒也能影響必需的RNA的產生而引發(fā)疾??；它們還可以作為一個不正常的調控分子，對個別基因的表達產生特殊的影響。（三）兩種形式的朊病毒的異同：

PrPCPrPSC功能：不詳導致退行性神經疾病分布：正常腦被感染腦抗蛋白酶性：可被完全降解只能被部分降解溶解性：可溶難溶一級結構：兩者相同二級結構：40%-螺旋20%-螺旋，50%-折疊（四）朊病毒的感染方式PrPSC作用需要PrPC的參與PrPSC蛋白的錯誤折疊形式可以催化天然PrPC分子從正常的可溶性的螺旋構象向不溶性的-折疊構象轉化，最終導致了疾病和感染。（五）朊病毒的多株現(xiàn)象不同PrPSC株可使一種PrP結構轉化為不同的構型；而同一種PrPSC可以在具有不同PrP蛋白的多種生物中傳代，即使經過多次傳代仍然保持自身的生物學特征。（六）朊病毒是遺傳物質嗎？多株現(xiàn)象難以解釋其感染方式能否被視為遺傳復制？DNA中的常見堿基有：胞嘧啶（cytosine,C）、胸腺嘧啶（thymine,T）、腺嘌呤（adenine,A）和鳥嘌呤（guanine,G）(二）戊糖：核糖和脫氧核糖（三）脫氧核糖核苷（nucleoside）由堿基和戊糖（D-脫氧核糖）縮合而成。有4種脫氧核糖核苷：胞嘧啶脫氧核糖核苷、胸腺嘧啶脫氧核糖核苷、腺嘌呤脫氧核糖核苷和鳥嘌呤脫氧核糖核苷。++H2OH（五）脫氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid,DNA）脫氧核糖核苷酸以3’，5’磷酸二酯鍵聚合成為脫氧核糖核酸（DNA）鏈。鏈的一端的核苷酸有自由的5’磷酸基團，稱5’端；另一端核苷酸具有自由的3’羥基，稱3’端。一個脫氧核苷酸的3'端與下一個的5'端通過磷酸二酯鍵連接。DNA鏈的方向就是從5’端到3’端。DNA分子通常以線性或環(huán)狀的形式存在。大多數(shù)DNA由兩條互補的單鏈構成。少數(shù)生物的DNA，如某些噬菌體或病毒是以單鏈形式存在的。二、序列測定方法（一）小片段重疊法（二）凝膠直讀法1.酶法（1）加減法（Sanger,1975）（2）末端終止法(雙脫氧法/間接拷貝法)（Sanger,1977）2.化學法（Maxam/Gilbert,1977）適用于DNA短片段的測定雙脫氧核苷三磷酸酶、4種dNTPddATP5'TACGATCGTA3'5'TACGA3'5'TA3'ddGTP5'TACGATCGTATG3'5'TACGATCG3'5'TACG3'5'TACGATCGTAT3'5'TACGATCGT3'5'TACGAT3'5'T3'5'TACGATC3'5'TAC3'ddTTPddCTPAGTCGTATGCTAGCAT3'ATGCTAGCATAC5'5‘3'模板引物

三、一級結構的重要性

攜帶遺傳信息決定DNA的二級結構決定DNA的空間結構a.反平行雙鏈右手螺旋b.糖－Pi在螺旋線上c.堿基伸向內部其平面垂直于軸d.A=T、G=Ce.直徑=2nm，一圈上升10對核苷酸，螺距為3.4nmf.大溝（majorgroove）、小溝（minorgroove）Watson—Crick雙螺旋結構模型特點：（二）A-DNA構象為相對濕度改變（75%以下）或由鈉鹽變?yōu)殁淃}、銫鹽，DNA的結構可成為A構象。它是B-DNA螺旋擰得更緊的狀態(tài)。DNA-RNA雜交分子、RNA-RNA雙鏈分子均采取A構象。A-DNA、B-DNA和Z-DNA的一些結構特征

A-DNAB-DNAZ-DNA螺旋方向每圈螺旋的堿基數(shù)每一堿基對的上升距離螺距堿基對的傾斜度每一堿基對旋轉的角度螺旋直徑大溝小溝右手性110.255nm2.8nm20o33o

2.3nm窄而極深極寬而淺右手性10.40.34nm3.4nm6o36o

2.0nm寬而深窄而深左手性120.37nm4.5nm7o-60o

1.8nm平展極窄而深B-DNA是活性最高的DNA構象，B-DNA變成A-DNA后，仍有活性，但若局部變構為Z-DNA后，活性明顯降低。

二、決定雙螺旋結構狀態(tài)的因素（一）氫鍵1.堿基的氫供體氨基、羥基2.堿基的氫受體酮基、亞氨基3.G-C對及A-T對之間的氫鍵:（在一定范圍內DNA的穩(wěn)定性與G-C百分含量成正比）（二）堿基堆積力1，堿基堆積力同一條鏈中的相鄰堿基之間的非特異性作用力2，堿基堆積力的來源疏水作用力累積的VanderWaal的作用力3，堿基堆積作用的證據(jù)單鏈多核苷酸傾向于堿基平行排列的規(guī)則螺線結構破壞疏水作用和雙鏈的氫鍵可降低DNA的穩(wěn)定性Pu---PyPy---Pu堿基堆積形成積壓Pu的雙環(huán)結構，其長度接近或超過螺旋軸心每對Bp又以propellertwist形式存在相臨兩個Bp間的Pu發(fā)生過份的擠壓導致Bp的抵牾DNA分子的精細結構發(fā)生改變，產生構象的不安定狀態(tài)Pu的抵牾發(fā)生在小溝一側Pu的抵牾發(fā)生在大溝一側2倍抵牾力TA不穩(wěn)定GC穩(wěn)定（三）帶電荷的磷酸基的靜電斥力磷酸集團的負電對DNA雙鏈的穩(wěn)定性起負作用。陽離子可對之產生屏蔽。DNA溶液的離子濃度越低，DNA越不穩(wěn)定。（四）堿基分子內能堿基內能越高，氫鍵和堿基堆積力越容易被破壞，DNA雙鏈越不穩(wěn)定第四節(jié)DNA的三級結構

形成超螺旋的原因和條件：原因：因某種原因引入了額外的螺旋。條件：a,DNA雙螺旋閉合或被蛋白結合，末端不能自由轉動；b,DNA雙鏈上無斷裂。一、超螺旋結構DNA的三級結構是指DNA雙螺旋的進一步扭曲盤繞所形成的構象，主要表現(xiàn)為超螺旋結構。松弛態(tài)（relaxedstate）:DNA中心軸與平面平行即不扭曲的狀態(tài)。超螺旋：雙螺旋結構的DNA再次扭曲形成的螺旋結構。

a.右旋超螺旋——負超螺旋（Negativesupercoil）b.左旋超螺旋——正超螺旋（positivesupercoil）a.b.

環(huán)狀DNA分子的拓撲學性質L=T+WW=L-T

L：連環(huán)數(shù)（Linkingnumber）指一個封閉環(huán)狀DNA雙螺旋分子中的兩條鏈彼此盤繞的次數(shù)；

T：雙螺旋中轉數(shù)（Twistingnumber，也叫螺圈數(shù)）是雙螺旋本身所有的性質。其數(shù)量等于堿基對總數(shù)除以每一圈的堿基對數(shù)（如：5200÷10.4=500）；

W：超螺旋數(shù)（Writhingnumber）。

DNA的拓撲異構體：松弛型：W=0，L=T；負超螺旋：L<T；正超螺旋：L>T

例：動物病毒SV40的DNA（環(huán)狀，含5200bp），在無超螺旋時，L=500，T=500，W=0；但實際上從細胞中分離出的SV40DNA含有25個負超螺旋，所以它的L=475，因此，

L對一個DNA分子來講是一個拓撲學特性，在不發(fā)生鏈的斷裂時它是一個常數(shù)。（475=500-25）L=T+WW=L-T比連環(huán)差（Specificlinkingdifference)（以表示）用來表示超螺旋的程度；當初級螺旋數(shù)不變時，代表超螺旋密度。公式：=（L-L0）/L0（L0：表示松弛環(huán)型DNA的連環(huán)數(shù)）如一超螺旋DNA的L=23，L0=25，則=-0.08，大多數(shù)天然存在的DNA分子超螺旋密度在-0.03~-0.09之間。超螺旋結構存在的意義密度大，體積小，在細胞中所占體積較為經濟；超螺旋結構能影響雙螺旋的解鏈程度，因而影響DNA分子與其它分子，如酶、蛋白質等分子的相互作用，參與DNA復制、重組、轉錄等重要功能。DNA的拓撲異構體可用凝膠電泳分開。影響DNA高級結構的酶L值的改變需要至少一條DNA鏈斷裂一次。斷裂造成的DNA自由末段的一斷可繞著另一端旋轉，隨后被重新連接，DNA拓撲異構酶通過催化此類反應將DNA從一種拓撲結構轉變成另一種。l

拓撲異構酶

(topoisomeraseI,II)

參與構型的改變功能比較拓撲酶功能比較TopI對負超螺旋處的單鏈DNA具有極強的親合力TopII消除負超螺旋松弛B-DNA引入負超螺旋緊縮B-DNA1.I型DNA拓撲異構酶底物：DNA單鏈ATP：不需酶活性：DNA內切酶和連接酶活性代表：E.Coli的DNA拓撲異構酶I：可催化負超螺旋DNA轉化為松弛環(huán)型。鼠DNA拓撲異構酶I：對正、負超螺旋有相同的松弛能力。原理：E.coli拓撲異構酶識別部分解螺旋的DNA分子，與DNA單鏈部分結合后，切斷一條鏈，并以其酪氨酸殘基與DNA的5’磷酸相連。磷酸二酯鍵從DNA轉移蛋白質上。酶將完整的DNA鏈拉過缺口后（⊿L=+1），重新連接原先單鏈上磷酸二酯鍵。上述過程除了改變DNA的超螺旋結構外，還可使單鏈環(huán)狀分子形成三葉結構，以及使兩個單鏈環(huán)狀分子成為環(huán)連體分子。2.II型DNA拓撲異構酶底物DNA雙鏈ATP需要酶活性DNA內切酶和連接酶活性代表E.Coli旋轉酶（DNA拓撲異構酶II），可引入負超螺旋。無ATP時，此酶只能緩慢地松弛負超螺旋。E.Coli的旋轉酶還具有形成和拆開雙鏈DNA環(huán)連體和成結分子的能力。此類酶無堿基序列特異性。3.DNA拓撲異構酶催化反應的實質：其本質是先切斷DNA的磷酸二酯鍵，改變DNA的鏈環(huán)數(shù)后再連接，兼具DNA內切酶和DNA連接酶的功能。然而這些酶并不能連接事先已經存在的斷裂DNA，即其斷裂及連接反應是相互偶聯(lián)的。二、生物體內的超螺旋1.環(huán)狀DNA的超螺旋生物體如某些小病毒、細菌質粒、真核線粒體、葉綠體、噬菌體PM2、以及某些細菌的DNA為雙鏈環(huán)狀，在細胞內進一步扭曲形成超螺旋的三級結構。2.染色體DNA的三級結構

為DNA雙螺旋盤繞在組蛋白上的超螺旋結構。

H1DNA繞聚合體1.75圈，左旋H2A、H2B、H3、H4各2分子組成聚合體H1結合在核小體間的DNA上組蛋白三、三股螺旋DNA

(TribleHelixDNA,T.SDNA)

※T.SDNA的發(fā)現(xiàn)與證實

l

1953年以前Pauling(Chemist)提出T.SDNA存在的可能性

l

1953年Watson&CrickD.SDNAmodel證明沿大溝存在多余的氫鍵給體與受體潛在的專一與DNA(蛋白質)

結合的能力形成T.SDNA可能性

l

1957年Davis,Felsenfeld,Rich發(fā)現(xiàn)poly(U)+poly(U)+poly(A)T.SRNA

T.SDNA的概念l

1966年Miller&Sobell

實現(xiàn)RNA+D.SDNATriblepolyNt

asRepressor關閉基因

但由于D.SDNA的提出而被忽視但因證明LacI產物為Repressor而被忽視

●

1975年Perlgut人工合成T.SDNA并證明其Tm值,沉降系數(shù)(S)

l

1987年Mirkin.S.M

Nature330(495)證明plasmidDNA在pH=4.3的溶液中,有T.SDNA的存在

●

1987年Dervan.Moser

Science238(645)合成S.SDNA+D.SDNA→T.SDNA

實現(xiàn)DNA的定點切割研究X-rayphotograph

核磁共振→結構功能

繼Davis（1957）后30年第一次證明T.SDNA在生物體內的存在

※T.S.DNA的類型

PolyT/A

TTTTTTTTTTT

AAAAAAAAAA

PolyT/A

TTTTTTTTTTT

AAAAAAAAAATTTTTTTTTTTAAAAAAAAAATTTTTTTTTTTAAAAAAAAAA●1.D.S.DNA+D.S.DNA

T.S.

DNA+

S.S.DNAHomologouspalindromicsequenceinaD.S.DNANoduleDNAorHingedDNA三鏈螺旋雙鏈螺旋HingedDNAHingedDNA

l

2.

S.S.DNA+D.S.DNAT.S.DNA☆

PU

+PU/PY(偏堿性介質中穩(wěn)定)☆

PY

+PU/PY(偏酸性介質中穩(wěn)定)常見類型

第三條鏈位于B-DNA的

Majorgroove中與D.S.DNA一起旋轉T.S.DNA的連接鍵

WatsonbondingA＝TG≡C(D.S.DNA)H+HoogsteenbondingG＝C+(pH小于7)第三鏈質子化第二鏈的pu6‘,7’與第三鏈的堿基形成H鍵

三股螺旋DNA形成的條件及結構特點第三條單鏈DNA分子位于B-DNA大溝內與B-DNA以

Hoogsteen

鍵連接TriblehelixMajorgroovePy:Pu:Py3ed

在Py/Pu:

Py

結構中AT,GC+兩氫鍵配對C質子化鏡相結構必需條件T.S.DNA可能的功能

a)T.S.DNA可阻止調節(jié)蛋白與DNA結合,關閉基因轉錄過程

b)T.S.DNA與基因重組,交換有關

加入第三條S.S.DNA作為分子剪刀(molecularscissors),

定點切割DNA分子

d)加入反義的第三條鏈(anti-sencepolydNt)終止基因的表達

四、四股螺旋DNA

(tetraplexDNA,TetrableHelixDNA)

發(fā)現(xiàn)

均有形成四股螺旋DNA的可能

5’---TTAGGGTTAGGGTTAGGG-3’3’---AATCCCAATCCC-5’染色體端粒高度重復的DNA序列著絲點附近的高度重復序列

結構特點LinkedbyHoogsteenBonding7GGGG67677662×poly(T4G4)2×poly(G4C4)

結構特點5‘3‘TTTGGGGGGGGGGGGGGGGGGTTTTTTGGGGTTTGGGGTTTGGGGTTT真核生物染色體端粒DNA結構可能的功能

A穩(wěn)定真核生物染色體結構

B保證DNA末端準確復制

C與DNA分子的組裝有關

D與染色體的meiosis&mitosis有關

HoogsteenBonding

5’-----TTAGGGTTAGGGTTAGGGT

3’-----AATCCCAATCCC

GGG

TA第五節(jié)DNA的變性、復性、

雜交和Cot曲線一、DNA的變性DNA變性（熔解）：DNA被加熱或某些試劑的作用下，配對堿基之間氫鍵和相鄰堿基之間的堆積力受到破壞，逐步變?yōu)榻朴跓o規(guī)則的線團構像的過程。（一）單、雙鏈DNA的紫外光吸收雙鏈DNA：A260=1.0時，50μg/ml單鏈DNA：A260=1.0時，33μg/ml（單鏈RNA：A260=1.0時，40μg/ml）●

D.S.DNAS.S.DNA

(加溫,極端pH,尿素,酰胺)

（二）DNA的熔解曲線Tm值：緩慢而均勻地升高DNA溶液的溫度，當A260增加到最大增值的一半時的溫度，叫做DNA的熔解溫度（Meltingtemperature）或熔點，用Tm表示。（一般在70-85℃）DNA變性不僅受外部各種因素的影響，而且取決于DNA分子本身的穩(wěn)定性，即Tm值直接與DNA的性質相關。溫度單鏈(%)10050Tm溫度單鏈(%)10050TmTmTmPolyA-TDNApolyG-C1.1851.01.37OD℃=OD增加值的中點溫度(一般為85-95℃)

Tm

(meltingtemperature)

=midpointofthetemperaturerangeoverwhichDNAisdenatured不同DNA的Tm值對G-C含量作圖能得到一條直線，因此測定Tm值可以推算出DNA堿基分子組成。（三）影響Tm值的因素

☆在A,T,C,G隨機分布的情況下☆GC%含量相同的情況下GC%愈高→Tm值愈大GC%愈低→Tm值愈小

AT形成變性核心，變性加快，Tm值小堿基排列對Tm值具有明顯影響（除變性核心外）（堿基堆積力的差異）

☆大片段D.S.DNA分子之間比較片段長短對Tm值的影響較小,與組成和排列相關☆小于100bp的D.SDNA分子比較片段愈短，變性愈快，Tm值愈小☆變性液中含有尿素，酰胺等尿素，酰胺與堿基間形成氫鍵改變堿基對間的氫鍵Tm值可降至40℃左右

☆鹽濃度的影響

單鏈DNA主鏈的磷酸基團負電荷的靜電斥力兩條單鏈DNA的分離Na+在磷酸基團周圍形成的電子云對靜電斥力產生屏蔽作用減弱靜電斥力Tm↑當Na+濃度低屏蔽作用小斥力加強Tm↓靜電斥力

熵值（△S）TmODA260

0.01M0.1M1.0MNa+當Na+濃度高

屏蔽作用大斥力減弱熵值(△S)上升堿基溶解性降低疏水作用力增加二、復性DNA復性：變性DNA在一定條件下恢復天然DNA結構的過程。（一）復性的條件1，消除磷酸基的靜電斥力；2，破壞連內氫鍵（二）復性的機制1，隨機碰撞取決于DNA濃度、溶液溫度、離子強度等2，成核作用（nucleation)3，拉拉鏈作用（zippering）3’-ATCTATGCTGTCAT-5’5‘-TAGATACGACAGTA-3’5‘-TAGATACGACAGTA-3’3’-ATCTATGCTGTCAT-5’3’-ATATATATATAT-5’5‘-TATATATATATA-3’3’-ATATATATATAT-5’5‘-TATATATATATA-3’5‘-TATATATATATA-3’3’-ATATATATATAT-5’3’-ATATATATATAT-5’5‘-TATATATATATA-3’影響DNA復性過程的因素：

陽離子濃度0.18~0.2MNa+可消除polydNt間的靜電斥力復性反應的溫度Tm-25℃(60-65℃)以消除S.S.DNA分子內的部分二級結構

S.S.DNA分子的長度S.S.DNA愈長S.S.DNA愈短→分子擴散愈慢→復性愈慢→分子擴散愈快→復性愈快影響DNA復性過程的因素：

DNA分子中,dNt

的排列狀況(隨機排列,重復排列)

S.S,DNA的初始濃度C0三、Cot曲線在一定條件，復性速度變化可用Cot值衡量。Co表示變性DNA的最初濃度（bp，mol/L），T為復性時間（s），即Cot值為變性DNA的最初濃度與復性時間的乘積（mol·s/L）。病毒和原核生物基因組的Cot曲線是單一的s形曲線，真核生物基因組的Cot曲線是多s形Cot曲線，重復頻率高的序列復性速度快，重復頻率低的則慢。135001.7×1054.2×106bpK.C.2×10-68×10-23×10-19Cot1/2不同物種核酸的Cot曲線原核生物DNA的復性動力學原核生物Cot曲線形狀：不同生物曲線形狀相似，都是單一的S形；原核生物Cot曲線：跨度一般只有兩個數(shù)量級；原核生物Cot曲線位置：基因組越大越靠右。Cot（mol·s/L）真核生物Cot曲線特點：階梯狀，跨度7-8個數(shù)量級。真核生物Cot曲線的組成：快復性組分/中間復性組分/慢復性組分。真核生物DNA復性動力學

E.ColiDNACt/C0

C0

t0.036300040%60%CalfthymusDNA10四、雜交重要的雜交技術：SouthernBlottingNorthernBlotting一、RNA的結構特征RNA的堿基組成與一級結構（1）堿基組成：A、G、C、U（2）一級結構：基本組成單位——核苷酸（AMP、GMP、CMP、UMP）核苷酸間的連接鍵——3‘—5’磷酸二酯鍵存在狀態(tài)——單鏈、只有少數(shù)為雙鏈（暗色蛾CPVRNA5150bp）

第六節(jié)RNA的結構雙螺旋、內部環(huán)、單堿基、突起和突環(huán)、發(fā)夾環(huán)、多分支環(huán)或結合環(huán)、假結、單鏈區(qū)二、RNA二級結構元件：多分支環(huán)突環(huán)單堿基突起發(fā)夾結構（莖環(huán)結構）內部環(huán)雙螺旋假結單鏈區(qū)三、mRNA結構

1.原核生物mRNA為多順反子mRNA（polycistron），即一條mRNA可編碼幾條肽鏈。無帽子結構和尾巴，不含稀有堿基，半壽期為1~3min，二級結構有豐富的自身回折產生的雙鏈區(qū).

2.真核生物mRNA為單順反子