流式細胞術

---原理及應用什么是流式細胞術？流式細胞儀由哪些結(jié)構(gòu)組成？各個系統(tǒng)的工作原理是什么？流式細胞儀能做些什么？1.1流式細胞術簡介流式細胞術（FlowCytometry，F(xiàn)CM）：是以流式細胞儀為檢測手段的一項能快速、精確的對單個細胞(或生物學顆粒)的理化特性進行多參數(shù)定量分析和分選的技術。在流動的狀態(tài)中檢測細胞或顆粒的各項特性。檢測參數(shù)：多參數(shù)；檢測速度：高速，最高達上萬個細胞/秒；檢測結(jié)果：精度高、準確性好；檢測對象：單細胞懸液或生物顆粒檢測特點：單細胞水平分析可對目標細胞進行分選

流式：單個細胞分析，收集每個細胞的數(shù)據(jù)，更精準；WB：群體分析，得到多個細胞的平均值。1.2流式細胞儀的結(jié)構(gòu)組成液流系統(tǒng)流動室液流驅(qū)動系統(tǒng)光學系統(tǒng)激發(fā)光源光束收集系統(tǒng)電子系統(tǒng)光電轉(zhuǎn)換器數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)細胞分選系統(tǒng)噴嘴電偏轉(zhuǎn)板樣本收集器液流驅(qū)動系統(tǒng)液流系統(tǒng)鞘流技術：根據(jù)層流原理發(fā)展起來的技術，可以實現(xiàn)兩種液體的同軸流動，樣本細胞流位于軸心穩(wěn)定流動，外面包裹有鞘液(sheath)。流體動力學聚焦：穩(wěn)定的液流從截面積較大的部分流入截面積較小的部分后，有一個聚焦收縮作用，細胞流直徑被約束在10-20um，避免了多個細胞重疊進入檢測區(qū)。鞘液的作用：1.約束樣品位于噴嘴中心，提高測量精度；2.防止樣品靠近噴孔壁，避免堵塞噴空；3.鞘液與細胞流同軸流動防止細胞流發(fā)生湍流。鞘液鞘液細胞流激光照射點流體動力學聚焦示意圖進樣速率控制通過改變樣本壓力可以調(diào)節(jié)樣本的進樣速率，而這并不是提高樣本流的流速，而是改變了細胞之間的距離。高速時樣本流變寬，單位時間內(nèi)流經(jīng)激光照射區(qū)的細胞數(shù)就增加，這樣會導致變異系數(shù)增加。光收集系統(tǒng)濾光片的組成長通濾片(LP)：只允許特定波長以上的光束通過；短通濾片(SP)：只允許特定波長以下的光束通過；帶通濾片(BP)：只允許一定波長范圍內(nèi)的光束通過。Long

passShortpassBandpass460500540SP500LP500BP500/50460500540460500540流式細胞儀信號檢測系統(tǒng)透射光路FACSCantoII雙激光六色電子系統(tǒng)光電檢測器將光信號轉(zhuǎn)換成電子信號。前置放大電路將信號等比例放大，輸出電脈沖信號。模數(shù)轉(zhuǎn)換器將模擬的電脈沖信號轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號。數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)計算機系統(tǒng)數(shù)據(jù)采集、分析。（一）光電檢測器(photodetector)光電二極管(photodiode)光靈敏度低，測定強信號（FSC）；光電倍增管(photomultiplier,PMT)光靈敏度高，測定弱信號（SSC,FL1,FL2,FL3,FL4)。PMT前向散射光光電二極管（二）電信號兩種放大方式由于光信號比較弱，需將其等比例放大，方便計算機分析處理，一般信號的放大可以使用線性或?qū)?shù)兩種方式。

線性(linear;lin)對數(shù)(logarithmic;log)一般FSC和SSC變異范圍較小，故使用線性放大；熒光信號變異范圍較大，多使用對數(shù)放大。1.3流式細胞術光信號檢測光信號的類型散射光信號：與標記熒光素無關，是細胞的固有參數(shù)。前向散射光(forwardscatter,FSC);側(cè)向散射光(sidescatter,SSC).熒光信號自發(fā)熒光：微弱特異熒光：標記的熒光素分子發(fā)出

的熒光，比自發(fā)熒光強很多倍。散射光信號（一）前向散射光FSC

FSC信號方向與激光束平行，偏離度一般在1-6度范圍內(nèi)，亦稱小角度散射光，主要反映被測細胞的體積大小和活力。（二）側(cè)向散射光SSCSSC方向與激光束和液流形成的平面相垂直，亦稱90度散射光，其信號強度反映細胞內(nèi)部顆粒度和精細結(jié)構(gòu)的變化。（三）散射光的作用實驗中，常利用FSC和SSC這兩種參數(shù)的組合，區(qū)分不同的細胞群體，去除碎片、死細胞和粘連細胞的干擾。粒細胞單核細胞淋巴細胞紅細胞、死細胞和碎片閾值Threshold閾值：溶液中的雜質(zhì)或者死細胞，很容易產(chǎn)生微小的干擾信號，所以必須設置閾值，排除雜質(zhì)、細胞碎片或體積較小的死細胞。FSC反映細胞體積的大小，F(xiàn)CM應用時常選取FSC設定閾值。5%32%默認閾值升高閾值后

熒光信號（一）熒光：

物質(zhì)中的電子吸收光的能量由低能狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楦吣軤顟B(tài)，再回到低能狀態(tài)時釋放出的光。發(fā)射波長(熒光波長)Emissionwavelength激發(fā)波長Excitationwavelength＜（二）常用熒光素<499nm藍色熒光（Blue）；

500-549nm，綠色熒光（Green）；550-584nm，黃色熒光（Yellow）；

585-615nm，橙色熒光（Orange）；616-700nm，紅色熒光（Red）；

≥700nm，遠紅外熒光（Far-Red）。標記抗體的熒光素熒光素分子激發(fā)光波長（nm）發(fā)射光波長（nm）中文名FITC490520異硫氰酸熒光素PE488575藻紅蛋白PerCP490675多甲藻葉綠素蛋白APC650660別藻青蛋白PE-Cy5496/546670藻紅蛋白-花青素5PE-Cy7496/546767藻紅蛋白-花青素7Alexa

Flour488495519AlexaFlour647650665核酸熒光染料PI（碘化丙啶535,623）可選擇性的插入核酸雙螺旋堿基對中。常用于DNA分析，需要用RNase處理細胞排除RNA對DNA熒光定量的影響；PI不能透過活細胞膜，常用于鑒定死細胞。7-AAD（7-氨基放線菌素D545,647）以插入的方式與DNA鏈的G-C堿基對結(jié)合，不能透過活細胞膜，常用于鑒定死細胞。DAPI（4,4,6-二脒基二苯基吲哚358,456）可以非嵌入方式與DNA鏈上的A-T堿基對特異性結(jié)合。變異系數(shù)明顯小于其他染料，一種理想的DNA定量染料。Hoechst（343,450）常見為Hoechst33342和Hoechst33258，非嵌入的方式與DNA鏈上的A-T堿基對結(jié)合。能對活細胞染色，用于活細胞DNA定量分析，如精子分選；還用于側(cè)群細胞的分選。PY（派若寧560,573）RNA染料，能進入活細胞。AO（吖啶橙509,525）DNA、RNA染料，染色后DNA呈黃綠色熒光，RNA呈橙黃色熒光，可進行DNA/RNA雙參數(shù)分析。細胞周期(CellCycle)

原理：細胞在有絲分裂的過程中，核內(nèi)的DNA會進行復制，造成DNA含量的變化。如果把處于G0/G1期的細胞的DNA含量看做2N的話，處于G2/M期的細胞的DNA含量則為4N。熒光染料碘化丙錠（PropidiumIodide，PI）是一種核酸特異性染料，染料的熒光強度與結(jié)合的DNA數(shù)量成正比。根據(jù)PI的這種特性，我們常常用它來揭示細胞內(nèi)DNA倍性的關系，從而推導出細胞群體的周期分布。細胞凋亡(Apoptosis)

原理：細胞程序性死亡/細胞凋亡（apoptosis）是機體移除不需要的細胞的一種常見的機制。細胞凋亡早期的標志事件之一是磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine，PS）從胞膜內(nèi)表面到外表面的轉(zhuǎn)移。AnnexinV（AV）和PS有很強的親和力，所以被熒光標記后常常在流式中被用來檢測外翻的PS。在細胞凋亡后期，細胞膜與核膜常常會破裂。這種現(xiàn)象在流式中可以用PropidiumIodide（PI）檢測。PI是一種核酸特異性染料。當細胞膜完整時，PI無法穿透胞膜，故無法對細胞核進行染色。AV與PI共同使用時，可以對細胞凋亡的各個時期進行檢測：正?；罴毎@示AV和PI的雙陰性；早凋細胞顯示AV陽性和PI陰性；晚凋細胞則顯示AV和PI的雙陽性。然而，可以被AV和PI共同染色的細胞并不一定處于凋亡晚期。壞死的細胞在晚期也會被AV和PI共同染色。所以要想做到對細胞凋亡精確的檢測則需要對整個凋亡過程進行監(jiān)測，即AV陰性&PI陰性→AV陽性&PI陰性→AV陽性&PI陽性。

FCM可檢測下列細胞成分：表面標記物胞漿標記物核內(nèi)標記物可溶性成分免疫熒光染色黏附因子表面受體細胞因子分泌到胞外的細胞因子胞內(nèi)抗原核酸含量核內(nèi)抗原免疫熒光染色主要包括直接和間接免疫熒光染色兩種方法。間接標記的方法難以進行多色標記，而且操作復雜、信噪比高，所以一般首先直標熒光抗體。熒光抗體熒光二抗第一抗體直接標記間接標記熒光抗體的選擇本實驗室的FACSCantoII配置兩根激光器激發(fā)六色熒光。第一激光器：488nm藍色固態(tài)激光器激發(fā)四色。第二激光器：633nm紅色氦氖激光器激發(fā)二色。熒光濾片：488nm激光：530/30nm、585/42nm、695/40nm、780/60nm633nm激光：660/20nm、780/60nm總共可以檢測6色熒光可選擇的熒光如下：B根據(jù)抗原表達強弱合理選擇抗體不同的熒光素強度有所不同；高表達的抗原可用不太“亮”的染料，更“亮”的熒光素分配給表達低的抗原：CD4-FITC、CD25-APC、Foxp3-PEC選擇熒光波譜間光譜