第二章基因工程工具酶工具酶

-----DNA分子的切割和連接技術(shù)。

Smith發(fā)現(xiàn)了第一個Ⅱ型限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionendonuclease，RE)對DNA分子有特異地切割作用。（手術(shù)刀剪）

Khorana又發(fā)現(xiàn)了T4DNA連接酶（Ligase），能將DNA片段連接在一起。（縫紉機(jī)、漿糊）

DNA、RNA聚合酶和反轉(zhuǎn)錄酶等合成酶。（復(fù)印機(jī)）

構(gòu)成了一個研究DNA、RNA分子的工具酶箱。第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶

限制性核酸內(nèi)切酶是一類能夠識別雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列，并由此切割DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的核酸內(nèi)切酶。一、宿主的限制和修飾現(xiàn)象----發(fā)現(xiàn)

1952～1953年在T偶數(shù)噬菌體和λ噬菌體對大腸桿菌的感染實驗中研究者發(fā)現(xiàn)了細(xì)菌的限制和修飾現(xiàn)象。正是對限制和修飾現(xiàn)象的深入研究，導(dǎo)致限制性內(nèi)切核酸酶的發(fā)現(xiàn)。

寄主控制的限制與修飾現(xiàn)象由兩種酶活性配合完成的，一種叫修飾的甲基轉(zhuǎn)移酶，另一種叫核酸內(nèi)切限制酶。寄主控制的限制與修飾的作用，一是保護(hù)自身的DNA不受限制；二是破壞外源DNA使之迅速降解。

根據(jù)限制-修飾現(xiàn)象發(fā)現(xiàn)的核酸內(nèi)切限制酶，現(xiàn)在已成為重組DNA技術(shù)學(xué)的重要工具酶。純化后的限制性內(nèi)切酶允許分子生物學(xué)家以一種精確的可重復(fù)的方式切割基因克隆所需的DNA分子。這些酶的發(fā)現(xiàn)是基因工程發(fā)展過程中的一項突破性進(jìn)展。二、限制性核酸內(nèi)切酶的類型

根據(jù)其識別和切割序列的特性、催化條件及修飾活性等，一般將限制酶分為I，Ⅱ，Ⅲ三大類。

I類：不適用于基因工程。只在腸道菌中發(fā)現(xiàn)。

Ⅱ類：基因工程的工具酶。

Ⅲ類：切割位點不在識別位點，一般離識別位點24bp～26bp，對分子克隆操作亦無實用意義。已有超過1200種。性質(zhì)

I型限制性核酸內(nèi)切酶蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能由3個亞基組成的復(fù)合功能酶；α內(nèi)切酶活性，β甲基化酶活性，γ特異性識別序列識別部位不對稱序列AACN6GTGC切割部位非特異性，距識別部位大于1000bp限制作用所需的輔助因子ATP、Mg2+、S-腺苷甲硫氨酸性質(zhì)

Ⅲ型限制性核酸內(nèi)切酶蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能由2個亞基組成的雙功能酶；M亞基位點識別與修飾，R亞基內(nèi)切活性識別部位5-7bp的不對稱序列切割部位非特異性，距識別部位一側(cè)24-26bp限制作用所需的輔助因子ATP、Mg2+、S-腺苷甲硫氨酸性質(zhì)Ⅱ型限制性核酸內(nèi)切酶蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能獨(dú)立的內(nèi)切酶和甲基化酶識別部位短小的回文序列（多數(shù)4-6bp）切割部位同于或接近于識別部位限制作用所需的輔助因子Mg2+三、限制性核酸內(nèi)切酶的命名

H.D.Smith等于1973年提議的命名系統(tǒng)。名稱的第個1字母取自它來源細(xì)菌屬名的第1個字母，大寫；第2，3二個字母取自它來源細(xì)菌的種名的頭2個字母，小寫；如果它的來源菌還有株系，則有第4個字母；若酶的編碼基因位于噬菌體或質(zhì)粒上，則用一個大寫字母表示此染色體外的遺傳成分；最后用大寫羅馬數(shù)字，代表同一菌株中不同限制酶的編號。前三個字母用斜體表示。

第一個字母取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌屬名，用大寫；第二、第三個字母是該細(xì)菌的種名，用小寫；第四個字母代表株；用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。命名Hin

dⅢ

屬

種

株序Haemophilus

influenzaed株流感嗜血桿菌d株的第三種酶所有的限制酶，除了以上名稱外，前面還冠以系統(tǒng)名稱內(nèi)切酶系統(tǒng)名稱R；甲基化酶系統(tǒng)名稱M。例如R.HindⅢ，表示內(nèi)切酶

M.HindⅢ，表示甲基化酶但現(xiàn)在限制性內(nèi)切酶名稱中的R省略不寫。通常情況下，需要對克隆的DNA進(jìn)行切割。首先，如果以克隆單個基因為目的，該單個基因可能僅僅包含2-3kbDNA，則這個基因不得不從大的(通常情況下超過80kb)DNA分子中切割出來。其次，大的DNA分子不得不被切斷成小的足以被載體攜帶的片段。絕大多數(shù)克隆載體能夠承載的DNA片段處于一個特定的大小范圍中。比如，以M13噬菌體為基礎(chǔ)的載體，所克隆的DNA分子超過3kb時運(yùn)載效率非常低。四、Ⅱ型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特征

Ⅱ型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性識別雙鏈DNA分子中4--8對堿基的特定序列大部分酶的切割位點在識別序列內(nèi)部或兩側(cè)識別切割序列呈典型的旋轉(zhuǎn)對稱型回文結(jié)構(gòu)(palindrome)

。

GGATCCCCTAGGBamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口切口

：平端切口、粘端切口5’粘端切口GAATTCCTTAAG

EcoRⅠGCTTAAAATTCGCTCGAGGAGCTCCTCGAGGAGCTC

PstⅠ3’粘端切口DNA分子中識別序列的出現(xiàn)頻率對特定的限制性內(nèi)切酶來說，在已知長度的DNA分子中,識別序列的數(shù)量能夠通過數(shù)學(xué)方法計算出來。這一算法假定核苷酸以一種隨機(jī)方式排列而4個不同核苷酸以相同的比例出現(xiàn)(例如GC含量：50％)。一個四核苷酸序列(如GATC的酶)每44=256個核苷酸出現(xiàn)一次。實際上，這些假設(shè)不可能完全有效。如，λDNA分子，49kb，GC的含量要少于50％。對一個六核苷酸識別序列的限制性內(nèi)切酶來說應(yīng)該具有12個酶切位點。實際上，這些識別位點發(fā)生的頻率要小一些，如：BglⅡ有6個，

BamHI有5個，

SalI則只有2個。同功異源酶來源不同的限制酶，但能識別和切割同一位點，這些酶稱同功異源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BstⅠ同尾酶有些限制性內(nèi)切酶雖然識別序列不完全相同，但切割DNA后，產(chǎn)生相同的粘性末端，稱為同尾酶。這兩個相同的粘性末端稱為配伍未端(compatibleend)。BamHⅠBglⅡGGATCCCCTAGGAGATCTTCTAGAGCCTAG

GATCCG++ATCTAG

GATCTA五、限制性內(nèi)切酶的酶切反應(yīng)條件1.為內(nèi)切酶提供一個合適的環(huán)境(buffer)。所有限制性內(nèi)切酶Ⅱ都需要在鎂離子存在下才發(fā)揮作用。離子強(qiáng)度通常由氯化鈉(NaCl)提供。絕大多數(shù)限制性內(nèi)切酶的最適pH在7.4左右。不當(dāng)?shù)沫h(huán)境，不僅會降低限制性內(nèi)切酶的活性，還會導(dǎo)致酶的專一性的改變，使DNA切割額外的、非標(biāo)準(zhǔn)的識別序列。2.限制性內(nèi)切酶的用量供應(yīng)商提供純的已知濃度的溶液。1個酶單位：被定義為在合適的溫度與緩沖液中，在20μL反應(yīng)體系中，1h完全切割1μgDNA所需要的酶量。對于大量DNA的酶解，反應(yīng)體積可按比例擴(kuò)大，加入過量的酶（2～5倍）和較長的反應(yīng)時間。3.反應(yīng)溫度：絕大多數(shù)，37℃時活性達(dá)到最大；一小部分需要不同的工作溫度，如SamⅠ酶消化時，25℃才能達(dá)到酶的最大活性。BacⅠ酶消化時，50℃才能達(dá)到酶的最大活性。

4.酶解過程：

酶解體系的確定；成分的混勻；酶切反應(yīng)；終止反應(yīng)。

終止反應(yīng)的方法：

如果酶切下來的DNA片段用于克隆實驗，則反應(yīng)中的酶應(yīng)該消除掉以保證它不會意外地消化掉那些將在以后步驟中加入的其他DNA分子。“消滅”酶：

70℃保存很短的一段時間；苯酚抽提;

加入EDTA(鰲和Mg2+)或加入SDS使酶變性。5.限制性內(nèi)切酶的酶切結(jié)果鑒定6.內(nèi)切酶對DNA分子的不完全酶解：

完全酶切消化作用。

不完全酶切消化作用（構(gòu)建基因組物理圖譜、基因組文庫及片段連接）。減少酶量，增加反應(yīng)體系，縮短反應(yīng)時間。六、影響限制性內(nèi)切酶的活性的因素酶的純度DNA樣本的純度DNA甲基化的程度酶切反應(yīng)的溫度和時間DNA的分子構(gòu)型內(nèi)切酶的緩沖液

如果內(nèi)切酶處于非最適的反應(yīng)條件下其識別序列位點有時會發(fā)生改變，這時產(chǎn)生錯誤切割的能力叫內(nèi)切酶的星活性。高甘油含量內(nèi)切酶用量過大低離子強(qiáng)度高pH值含有機(jī)溶劑Mn2+、Cu2+、Zn2+等非Mg2+的二價陽離子存在。第二節(jié)DNA連接酶DNA連接酶的基本性質(zhì)修復(fù)雙鏈DNA上切口處的磷酸二酯鍵。DNA連接酶OHP5‘…

G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G…3’3‘…

C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C…5’nicknick3‘…

C-G-A-G

A-C-G-T-C-C-T-C

…5’5‘…

G-C-T-C-T-G-C-A

G-G-A-G…3’OHPds-DNA結(jié)構(gòu):切口,缺口,斷口缺口(gap)切口(nick)斷口(cut)3'HOP5'3'HOP5'5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G

…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C

…5’5‘…G-C-T-C-A-G-OH

P-C-T-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-T-C-P

OH-G-A-C-C-T-C…5’

T4-DNA連接酶DNA連接酶的基本性質(zhì)連接多個平頭雙鏈DNA分子。DNA連接酶連接作用的分子機(jī)理連接酶與輔助因子ATP（或NAD+）提供的激活A(yù)MP形成一共價結(jié)合的酶－AMP復(fù)合物（腺苷酰酶）。同時釋放出焦磷酸（Ppi）[或煙酰胺單核苷酸（NMN）]。激活的AMP從賴氨酸殘基轉(zhuǎn)移到DNA一條鏈的5’－末端磷酸基團(tuán)上形成DNA－腺苷酸復(fù)合物。3’－OH末端對活躍的磷原子作親核攻擊，形成磷酸二酯鍵將缺口封起來，同時釋放出AMP。3‘…

C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C

…5’5‘…

G-C-T-C-T-G-C-A

G-G-A-G…3’OHPT4DNA連接酶ATP酶-AMP+PPi大腸桿菌連接酶NAD+酶-AMP+NMN酶3‘…

C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C

…5’5‘…

G-C-T-C-T-G-C-A

G-G-A-G…3’OHPAPDNA連接酶的反應(yīng)條件Tris-HCl50-100mMpH7.5MgCl210mMATP0.5-1mM(不能大于1mM)DTTVolume10-20mlTT4-15℃4-16hr1UDNA連接酶的酶活性：在最佳反應(yīng)條件下15℃反應(yīng)1小時，完全連接1mgl-DNA（HindIII片段）所需的酶量1U酶已經(jīng)足夠DNA連接酶的種類T4噬菌體DNA連接酶分子量68Ku。是噬菌體基因30編碼的產(chǎn)物，需要ATP作為輔助因子。應(yīng)用最廣。大腸桿菌DNA連接酶分子量75Ku。是大腸桿菌基因組中的lig

基因編碼的產(chǎn)物，需要ATP作為輔助因子。不能連接平末端的兩端片段。假陽性背景低。影響連接反應(yīng)的因素溫度

酶最佳反應(yīng)溫度37℃，在此溫度下粘性末端之間氫鍵結(jié)合是不穩(wěn)定的。連接反應(yīng)最佳溫度需介于兩者之間。DNA末端的濃度

兩個DNA末端間的連接可認(rèn)為是雙分子反應(yīng)，標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件下，其反應(yīng)速率完全由相互匹配的DNA末端濃度決定。線性分子；環(huán)狀分子重組子的構(gòu)型與DNA濃度及DNA分子長度存在密切關(guān)系。小分子DNA片段易于分子內(nèi)連接；較長DNA片段濃度降低有利于分子環(huán)化，濃度增加利于分子間連接。平頭雙鏈DNA片段的連接操作從分子動力學(xué)的角度講，由限制性核酸內(nèi)切酶創(chuàng)造的粘性末端的連接屬于分子內(nèi)部的連接，而平頭末端的連接則屬于分子間的連接，因此后者反應(yīng)速度要慢得多提高平頭末端連接效率的方法包括：加大連接酶用量（10倍大于粘性末端的連接）加大平頭末端底物的濃度，增加分子間碰撞機(jī)會

加入10%PEG8000，促進(jìn)大分子之間的有效作用加入單價陽離子（NaCl），最終濃度150-200mM第三節(jié)DNA聚合酶DNA聚合酶（DNApolymerase）

能在引物和模板的存在下，把脫氧核糖單核苷酸連續(xù)的加到雙鏈DNA分子引物鏈的3’-OH末端，催化核苷酸的聚合作用。DNA聚合酶的分類

依據(jù)聚合酶使用的模板不同，將其分為兩類：依賴于DNA的DNA聚合酶依賴于RNA的DNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ(pol

Ⅰ)生物活性５’→３’ＤＮＡ聚活酶活性５’→３’外切酶活性３’→５’外切酶活性置換活性用途

５’ＣＣＧ-ＯＨ３’３’ＧＧＣＴＡＴＣＧＡ５’↓Mg2+

↓dNTPs

↓polⅠ↓５’ＣＣＧＡＴAGＣＴ３’３’ＧＧＣＴＡＴＣＧＡ５’５＇ＣＧＣＡＴＣＴ３＇３＇ＧＣＧＣＧＴＡＧＡ５＇↓↓Ｍg2＋↓polⅠ↓

５＇ＣＡＴＣＴ３＇３＇ＧＣＧＣＧＴＡＧＡ５＇＋５＇pＣ＋５＇pＧ５＇ＣＧＣＡＣＴ３＇３＇ＧＣＧ５＇↓Ｍg2＋↓polⅠ↓↓５＇ＣＧＣ-ＯＨ３＇３＇ＧＣＧ-p５＇＋５＇pＡ＋５＇pＣ＋５＇pＴ

dNTPs

抑制５＇Ｃ-Ｇ-Ｔ-Ｃ-Ｇ-Ｃ-Ｔ-Ｃ-Ｇ-Ｃ-Ｇ-Ｃ-Ｔ３＇３＇Ｇ-Ｃ-Ａ-Ｇ-Ｃ-Ｇ-Ａ-Ｇ-Ｃ-Ｇ-Ｃ-Ｇ-Ａ５＇↓↓DNase

Ⅰ５＇Ｃ-Ｇ-Ｔ-Ｃ-Ｇ-Ｃ-Ｔ-Ｃ-Ｇ-Ｃ-Ｇ-Ｃ-Ｔ３＇３＇Ｇ-Ｃ-Ａ-Ｇ-Ｃ-Ｇ-Ａ-Ｇ-Ｃ-Ｇ-Ｃ-Ｇ-Ａ５＇↓

↓Ｍg2＋,

polⅠ,＊

dNTP↓５＇Ｃ-Ｇ-Ｔ-Ｃ-Ｇ-Ｃ-Ｔ-Ｃ-Ｇ-Ｃ-Ｇ-Ｃ-Ｔ３＇３＇Ｇ-Ｃ-Ａ-Ｇ-Ｃ-Ｇ-Ａ-Ｇ-Ｃ-Ｇ-Ｃ-Ｇ-Ａ５＇５’→３’外切酶活性ＤＮＡ聚活酶活性用途

用切口平移方法標(biāo)記ＤＮＡ用于cＤＮＡ克隆中合成第二鏈用于對ＤＮＡ分子的３’突出尾進(jìn)行末端標(biāo)記

大腸桿菌DNA聚合酶I大片段（Klenow

）Klenow酶的基本性質(zhì)：大腸桿菌DNA聚合酶I經(jīng)枯草桿菌蛋白酶處理，獲得N端三分之二的大肽段，即為Klenow酶。

Klenow酶仍擁有5‘→3‘的DNA聚合酶活性和3‘→5‘的核酸外切酶活性，但失去了5‘→3‘的核酸外切酶活性。Klenow片段

補(bǔ)平限制酶切割ＤＮＡ產(chǎn)生的３’凹端用〔３２Ｐ〕dＮＴＰ補(bǔ)平３’凹端，對ＤＮＡ片段進(jìn)行末端標(biāo)記對帶３’突出端的ＤＮＡ進(jìn)行末端標(biāo)記在cＤＮＡ克隆中，用于合成cＤＮＡ第二鏈在體外誘變中，用于從單鏈模板合成雙鏈ＤＮＡ應(yīng)用Ｓanger雙脫氧末端終止法進(jìn)行ＤＮＡ測序消化限制酶產(chǎn)生的３’突出端應(yīng)用于ＰＣＲ技術(shù)Ｔ４噬菌體ＤＮＡ聚合酶

生物活性５'→３'ＤＮＡ聚合酶活性3'→5'外切核酸酶活性交換（置換）反應(yīng)用途

5‘CCGOH3'

3'GGCTACGA5'↓↓Mg＋＋↓T4DNA聚合酶↓dNTPs5'CCGATGCT3'3'GGCTACGA5'

5'CGCATCT3'

3'GCG5'

↓↓Mg＋＋↓T4DNA聚合酶↓5'CGCOH3'3'GCG5'

+

5'pA

+

5'pC

+

5'pT

5'CGTCGCOH3'

3'GCAGCG5'

↓↓Mg＋＋↓T4DNA聚合酶↓[α-32P]dTTP5'CGOH3'3'GCAGCG5'↓↓5'CGT*OH3'

3'GCAGCG5'

補(bǔ)平或標(biāo)記限制酶消化ＤＮＡ后產(chǎn)生的３'凹端對帶有３'突出端的ＤＮＡ分子進(jìn)行末端標(biāo)記標(biāo)記用作探針的ＤＮＡ片段將雙鏈ＤＮＡ的末端轉(zhuǎn)化成平端使結(jié)合于單鏈ＤＮＡ模板上的誘變寡核苷酸引物得到延伸TaqDNA聚合酶TaqDNA聚合酶是一種耐熱的依賴于DNA的DAN聚合酶，最初從極度嗜熱的水生菌中純化而來。它具有2種活性，需Mg2+作輔助因子。５’→３’DNA聚合酶活性；５’→３’外切核酸酶活性。主要應(yīng)用于PCR反應(yīng)。逆轉(zhuǎn)錄酶

禽源逆轉(zhuǎn)錄酶和鼠源逆轉(zhuǎn)錄酶生物活性５'→３'ＤＮＡ聚合酶活性ＲＮＡ酶Ｈ活性用途

類型性質(zhì)

禽源逆轉(zhuǎn)錄酶鼠源逆轉(zhuǎn)錄酶來源

來自純化的禽成髓細(xì)胞瘤病毒(AMV)從一株能表達(dá)克隆化的Moloney鼠白血病病毒(Mo-MLV)反轉(zhuǎn)酶基因的大腸桿菌中發(fā)離得到的

肽鏈

兩條多肽鏈

單鏈多肽

生物活性

無３'→５'外切核酸酶活性、聚合酶活性、強(qiáng)的ＲＮＡ酶Ｈ活性

無３'→５'外切核酸酶活性、聚合酶活性、弱的ＲＮＡ酶Ｈ活性

pＨ值

８．３７．６

５'→３'ＤＮＡ聚合酶活性

5'T

T

T

T

TOH3'3'AAAAAUCUGUCCUA5'↓↓Mg＋＋↓dNTPs↓逆轉(zhuǎn)錄酶

5'T

T

T

T

TAGACAGGAT3'

3'AAAAAUCUGUCCUA5'

ＲＮＡ酶Ｈ活性

RNA----5'UCCGUA3'

DNA----3'AGGCAT5'

↓逆轉(zhuǎn)錄酶↓

5'UC3'

3'AGGCAT5'

+

5'CGUA3'用途

逆轉(zhuǎn)錄酶主要用于將ｍＲＮＡ轉(zhuǎn)錄成雙鏈ｃＤＮＡ在此反應(yīng)中可用３種類型的引物：寡脫氧胸苷酸[12-18]聚體,oligodt特定序列的寡核苷酸標(biāo)記帶５'突出端的ＤＮＡ片段可用于雙脫氧鏈終止法測序

DNA和RNA的修飾酶

末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（terminaldeoxynucleotidyl

transf