☆選修3☆現(xiàn)代生物科技專題DNA重組技術(shù)的基本工具

1.基因工程的概念基因工程是指按照人們的愿望，進行嚴格的設(shè)計，通過__________和__________，賦予生物以__________的遺傳特性，創(chuàng)造出符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品?；蚬こ淌窃赺_________上進行設(shè)計和施工的，又叫做__________。DNA重組技術(shù)

體外DNA重組轉(zhuǎn)基因技術(shù)新DNA分子水平操作環(huán)境操作對象操作水平基本過程結(jié)果生物體外基因ＤＮＡ分子水平剪切拼接導(dǎo)入表達人類需要的基因產(chǎn)物基因拼接技術(shù)或DNA重組技術(shù)實質(zhì)：基因重組2.基因工程的基本工具(1)“分子手術(shù)刀”——__________①來源：主要是從__________中分離純化出來的。②功能：能夠識別雙鏈DNA分子的某種__________的核苷酸序列，并且使每一條鏈中__________部位的兩個核苷酸之間的__________斷開，因此具有__________性。③結(jié)果：經(jīng)限制酶切割產(chǎn)生的DNA片段末端通常有兩種形式：__________和__________。專一

限制性核酸內(nèi)切酶（限制酶）原核生物特定特定磷酸二酯鍵黏性末端平末端(2)“分子縫合針”——__________①兩種DNA連接酶（大腸桿菌DNA連接酶和T4-DNA連接酶）的比較：a.相同點：都縫合__________鍵。b.區(qū)別：大腸桿菌DNA連接酶只能將雙鏈DNA片段互補的__________之間的磷酸二酯鍵連接起來；而T4DNA連接酶能縫合_____________。②與DNA聚合酶作用的異同:DNA聚合酶只能將__________加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯鍵。DNA連接酶是連接__________的末端，形成磷酸二酯鍵。DNA連接酶

磷酸二酯黏性末端兩種末端單個核苷酸兩個DNA片段DNA連接酶注：DNA連接酶與DNA聚合酶的比較DNA連接酶DNA聚合酶作用實質(zhì)都是催化兩個脫氧核苷酸之間形成磷酸二酯鍵是否需模板不需要需要連接DNA鏈雙鏈單鏈DNA連接酶DNA聚合酶作用過程在兩個DNA片段之間形成磷酸二酯鍵將單個脫氧核苷酸加到已存在的核酸片段的3′端的羥基上，形成磷酸二酯鍵作用結(jié)果將存在的DNA片段連接成重組DNA分子合成新的DNA分子(3)“分子運輸車”——__________①運載體具備的條件a.能在受體細胞中復(fù)制并穩(wěn)定保存。b.具有一至多個限制酶切點，供外源DNA片段插入。c.具有標記基因，供重組DNA的鑒定。②最常用的運載體是__________,它是一種裸露的、結(jié)構(gòu)簡單的、獨立于__________核區(qū)DNA之外，并具有__________的雙鏈__________DNA分子。③其他運載體：__________、__________。動植物病毒載體質(zhì)粒細菌自我復(fù)制能力環(huán)狀噬菌體①解旋酶：該酶能在DNA復(fù)制或轉(zhuǎn)錄時破壞DNA堿基對間的氫鍵，從而將雙螺旋打開。②DNA水解酶：該酶能催化DNA水解。③RNA聚合酶：該酶能在轉(zhuǎn)錄時將單個的核糖核苷酸連接成RNA單鏈。區(qū)分以下幾種酶跟蹤訓(xùn)練（2008年全國卷Ⅰ）已知某種限制性內(nèi)切酶在一線性DNA分子上有3個酶切位點，如下圖中箭頭所指。如果該線性DNA分子在3個酶切位點上都被該酶切斷，則會產(chǎn)生a、b、c、d四種不同長度的DNA片段?，F(xiàn)有多個上述線性DNA分子，若在每個DNA分子上至少有1個酶切位點被該酶切斷，則從理論上講，經(jīng)該酶酶切后，這些線性DNA分子最多能產(chǎn)生長度不同的DNA片段種類數(shù)是（）A.3B.4C.9D.12C1．(2009年浙江高考題)下列關(guān)于基因工程的敘述，錯誤的是(

)A．目的基因和受體細胞均可來自動、植物或微生物B．限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶是兩類常用的工具酶C．人胰島素原基因在大腸桿菌中表達的胰島素原無生物活性D．載體上的抗性基因有利于篩選含重組DNA的細胞和促進目的基因的表達【答案】

D下列有關(guān)基因工程技術(shù)的正確敘述是（）A．重組DNA技術(shù)所用的工具酶是限制酶、連接酶和運載體B．所有的限制酶都只能識別同一種特定的核苷酸序列C．選用細菌作為重組質(zhì)粒的受體細胞是因為細菌繁殖快D．只要目的基因進入了受體細胞就能成功實現(xiàn)表達【答案】C基因工程的基本操作程序基礎(chǔ)梳理基因工程的基本操作程序包括：目的基因的獲取、基因表達運載體的構(gòu)建、將目的基因?qū)胧荏w細胞及目的基因的表達與檢測等四個步驟。1.目的基因的獲取(1)目的基因：__________。(2)原核基因采取__________獲得，真核基因通過__________獲得主要是編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因直接分離人工合成(1)直接分離：從自然界已有的物種中分離，如從基因文庫中獲取。(2)人工合成目的基因常用的方法有：①已知核苷酸序列的較小基因，直接利用DNA合成儀用化學(xué)方法合成，不需要模板。②以RNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下人工合成。反轉(zhuǎn)錄法化學(xué)合成法(3)PCR技術(shù)擴增目的基因①原理：__________。②過程：變性，退火，延伸。第一步：加熱至90～95℃__________；第二步：冷卻到55～60℃，引物結(jié)合到互補DNA鏈；第三步：加熱至70～75℃，熱穩(wěn)定DNA聚合酶從引物起始互補鏈的合成。2.基因表達運載體的構(gòu)建(1)目的：使目的基因在受體細胞中__________，并且可以__________，使目的基因能夠__________。(2)組成：__________＋__________＋__________＋__________DNA解鏈

DNA復(fù)制標記基因

穩(wěn)定存在遺傳至下一代表達和發(fā)揮作用目的基因啟動子終止子材料：Taq酶，引物，目的基因，脫氧核苷酸目的基因與運載體結(jié)合注意：要用相同的限制酶切割質(zhì)粒和目的基因①啟動子：是一段有特殊結(jié)構(gòu)的__________，位于基因的__________，是__________識別和結(jié)合的部位，能驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出__________，最終獲得所需的__________。②終止子：也是一段有特殊結(jié)構(gòu)的__________，位于基因的__________。③標記基因的作用：是為了鑒定受體細胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細胞篩選出來。常用的標記基因是_________

_。DNA片段首端RNA聚合酶mRNA蛋白質(zhì)DNA片段尾端抗生素抗性基因抗青霉素基因，抗四環(huán)素基因等3.將目的基因?qū)胧荏w細胞(1)轉(zhuǎn)化：目的基因進入受體細胞內(nèi)，并且在受體細胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達的過程。(2)常用的轉(zhuǎn)化方法將目的基因?qū)胫参锛毎翰捎米疃嗟姆椒ㄊ莀_________，其次還有__________和__________

等。將目的基因?qū)雱游锛毎鹤畛Ｓ玫姆椒ㄊ莀_________

。此方法的受體細胞多是__________。將目的基因?qū)胛⑸锛毎涸松镒鳛槭荏w細胞的原因是_______________________

___，最常用的原核細胞是_____________________。其轉(zhuǎn)化方法是：先用__________處理細胞，使其成為__________，再將重組表達運載體DNA分子溶于緩沖液中與感受態(tài)細胞混合，在一定的溫度下促進感受態(tài)細胞吸收DNA分子，完成轉(zhuǎn)化過程。農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法顯微注射技術(shù)受精卵繁殖快、多為單細胞，遺傳物質(zhì)少大腸桿菌Ca2+感受態(tài)細胞生物種類植物細胞動物細胞微生物細胞常用方法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法顯微注射技術(shù)Ca2＋處理法受體細胞體細胞受精卵原核細胞轉(zhuǎn)化過程將目的基因插入到Ti質(zhì)粒的T－DNA上→農(nóng)桿菌→導(dǎo)入植物細胞→整合到受體細胞的DNA→表達將含有目的基因的表達載體提純→取卵(受精卵)→顯微注射→受精卵發(fā)育→獲得具有新性狀的動物Ca2＋處理細胞→感受態(tài)細胞→重組表達載體與感受態(tài)細胞混合→感受態(tài)細胞吸收DNA分子(3)重組細胞導(dǎo)入受體細胞后，篩選含有基因表達運載體的受體細胞的依據(jù)是__________是否表達。4.目的基因的檢測與鑒定分子水平的檢測：(1)首先要檢測轉(zhuǎn)基因生物的染色體DNA上是否插入了目的基因，方法是采用______________。(2)其次還要檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA，方法是采用_____________________________________。(3)最后檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)，方法是從轉(zhuǎn)基因生物中提取蛋白質(zhì)，用相應(yīng)的抗體進行_________。個體水平的鑒定：有時還需進行______________的鑒定。如轉(zhuǎn)基因抗蟲植物是否出現(xiàn)抗蟲性狀。個體生物學(xué)水平標記基因DNA分子雜交技術(shù)用標記的目的基因作探針與mRNA雜交抗原－抗體雜交植物轉(zhuǎn)基因過程原生質(zhì)體DNA分子雜交技術(shù)DNA分子限制片段限制性酶切割瓊脂糖電泳轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上與放射性標記DNA探針雜交放射自顯影帶有DNA片段的凝膠凝膠濾膜用緩沖液轉(zhuǎn)移DNA吸附有DNA片段的膜探針必須經(jīng)過標記，以便示蹤和檢測。使用最普遍的探針標記物是同位素,但由于同位素的安全性，近年來發(fā)展了許多非同位素標記探針的方法。

歸納整合

一、外顯子與內(nèi)含子一般來說，真核生物的結(jié)構(gòu)基因都是由外顯子和內(nèi)含子組成原核細胞的基因真核細胞的基因不同點編碼區(qū)連續(xù)；結(jié)構(gòu)簡單編碼區(qū)有間隔，不連續(xù)；結(jié)構(gòu)復(fù)雜相同點都有編碼區(qū)和非編碼區(qū)；編碼區(qū)都有調(diào)控遺傳信息表達的核苷酸序列；編碼區(qū)上游都有與RNA聚合酶結(jié)合的位點

二、原核細胞與真核細胞的基因結(jié)構(gòu)的比較基因工程的應(yīng)用

基礎(chǔ)梳理1.植物基因工程：抗蟲、抗病、抗逆轉(zhuǎn)基因植物，利用轉(zhuǎn)基因改良植物的__________。2.動物基因工程：提高動物生長速度、改善畜產(chǎn)品品質(zhì)、用轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)__________。3.基因治療：_______________導(dǎo)入病人體內(nèi)，使該基因表達產(chǎn)物發(fā)揮作用。把正常的外源基因品質(zhì)藥物一、植物基因工程與動物基因工程的成果外源基因類型及舉例成果舉例抗蟲轉(zhuǎn)基因植物抗蟲基因：Bt毒蛋白基因、蛋白酶抑制劑基因、淀粉酶抑制劑基因抗蟲水稻、抗蟲棉、抗蟲玉米抗病轉(zhuǎn)基因植物抗病毒基因：病毒外殼蛋白基因、病毒的復(fù)制酶基因抗真菌基因：幾丁質(zhì)酶基因抗病毒煙草、抗病毒小麥、抗病毒番茄、抗病毒甜椒抗逆轉(zhuǎn)基因植物抗逆基因：滲透壓調(diào)節(jié)基因、抗凍蛋白基因、抗除草劑基因抗鹽堿和抗干旱的煙草、抗寒番茄、抗除草劑的大豆和玉米外源基因類型及舉例成果舉例改良品質(zhì)的轉(zhuǎn)基因植物優(yōu)良性狀基因：提高必需氨基酸含量的蛋白質(zhì)編碼基因、控制番茄成熟的基因、與花青素代謝有關(guān)的基因高賴氨酸玉米、耐儲存番茄、新花色矮牽牛提高生長速度的轉(zhuǎn)基因動物外源生長激素基因轉(zhuǎn)基因綿羊、轉(zhuǎn)基因鯉魚改善畜產(chǎn)品品質(zhì)的轉(zhuǎn)基因動物腸乳糖酶基因乳汁中含乳糖較少的轉(zhuǎn)基因外源基因類型及舉例成果舉例生產(chǎn)藥物的轉(zhuǎn)基因動物藥用蛋白基因+乳腺蛋白基因的啟動子等調(diào)控組件轉(zhuǎn)基因動物具有乳腺生物反應(yīng)器作器官轉(zhuǎn)移植供體的轉(zhuǎn)基因動物將外源的抗原決定基因表達的調(diào)節(jié)因子導(dǎo)入到器官供體基因組或除去供體的抗原決定基因無免疫排斥反應(yīng)的轉(zhuǎn)基因豬二、基因診斷與基因治療1.基因診斷(1)原理：DNA分子雜交。(2)過程：制備用放射性同位素（如32P）、熒光分子等標記的DNA（患者DNA）分子作探針；將待測DNA制成單鏈；讓兩者進行雜交，若兩者能進行互補配對，則說明患有此病，否則不患此病。2.基因治療(1)原理：把正常的外源基因?qū)胗谢蛉毕莸募毎?，達到治療疾病的目的。病人細胞中既有缺陷基因，也有正常基因。（體內(nèi)和體外）跟蹤訓(xùn)練（2009年安徽卷）2008年諾貝爾化學(xué)獎授予了“發(fā)現(xiàn)和發(fā)展了水母綠色熒光蛋白”的三位科學(xué)家。將綠色熒光蛋白基因的片段與目的基因連接起來組成一個融合基因，再將該融合基因轉(zhuǎn)入真核生物細胞內(nèi)，表達出的蛋白質(zhì)就會帶有綠色熒光。綠色熒光蛋白在該研究中的主要作用是（）A.追蹤目的基因在細胞內(nèi)的復(fù)制過程B.追蹤目的基因插入到染色體上的位置C.追蹤目的基因編碼的蛋白質(zhì)在細胞內(nèi)的分布D.追蹤目的基因編碼的蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)C基礎(chǔ)梳理蛋白質(zhì)工程是指以蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)規(guī)律及其生物功能的關(guān)系作為基礎(chǔ)，通過__________或__________，對現(xiàn)有蛋白質(zhì)進行__________，或制造一種__________，以滿足人類的生產(chǎn)和生活的需求。（基因工程在原則上只能生產(chǎn)_______________的蛋白質(zhì)）蛋白質(zhì)工程的崛起自然界已存在

基因修飾基因合成改造新的蛋白質(zhì)歸納整合一、蛋白質(zhì)工程1.蛋白質(zhì)工程的目的：生產(chǎn)符合人們生活需要的并非自然界已存在的蛋白質(zhì)。2.蛋白質(zhì)工程的基本原理蛋白質(zhì)工程的目標是根據(jù)人們對蛋白質(zhì)功能的特定要求，對蛋白質(zhì)基本結(jié)構(gòu)進行分子設(shè)計。由于基因決定蛋白質(zhì)，因此，要對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進行設(shè)計改造，