目標掌握：鹽析的原理及影響因素；有機沉淀的原理、常用有機溶劑，等電點沉淀的機制飽和溶液和過飽和溶液的概念熟悉：鹽析的操作過程和注意事項；有機沉淀操作條件的控制，操作過程中應注意事項結晶的一般步驟了解：其他沉淀法第五章固相析出分離法

一、概述1.定義——改變?nèi)芤簵l件使目標產(chǎn)物或雜質的溶解度降低而形成固體沉淀從溶液中分出的操作技術

析出物為晶體時稱為結晶，析出物為無定形固體時稱沉淀法2.特點——濃縮倍數(shù)高、操作簡便、經(jīng)濟、純化倍數(shù)低3.缺點：針對復雜體系而言，分離度不高、選擇性不強4、類型鹽析沉淀法有機溶劑沉淀法等電點沉淀法高分子聚合物沉淀法金屬離子沉淀法6)結晶法一般沉析操作的過程Step1

在經(jīng)過濾或離心后的樣品中加入沉析劑；Step2沉淀物的純化，促進晶體生長；Step3

離心或過濾，收集沉淀物；沉析器二、鹽析沉淀法

1.定義——是利用各種生物分子在濃鹽溶液中溶解度的差異，通過向溶液中引入一定數(shù)量的中性鹽，使目的物或雜蛋白以沉淀析出，達到純化目的的方法。★鹽析法應用最廣的是在蛋白質領域，已有八十多年的歷史,除了蛋白質和酶以外，多肽、多糖和核酸等都可以用鹽析法進行沉淀分離，20％～40％飽和度的硫酸銨可以使許多病毒沉淀，43％飽和度的硫酸銨可以使DNA和rRNA沉淀鹽析原理首先需要了解生物大分子在水溶液中的存在狀態(tài)：兩性電解質，由于靜電力的作用，分子間相互排斥，形成穩(wěn)定的分散系蛋白質周圍形成水化膜，保護了蛋白質粒子，避免了相互碰撞Electricdoublelayer鹽析過程當中性鹽加入蛋白質分散體系時可能出現(xiàn)以下兩種情況：（1）“鹽溶”現(xiàn)象—低鹽濃度下，蛋白質溶解度增大（2）“鹽析”現(xiàn)象—高鹽濃度下，蛋白質溶解度隨之下降，原因如下：無機離子與蛋白質表面電荷中和，形成離子對，部分中和了蛋白質的電性，使蛋白質分子之間的排斥力減弱，從而能夠相互靠攏；中性鹽的親水性大，使蛋白質脫去水化膜，疏水區(qū)暴露，由于疏水區(qū)的相互作用導致沉淀；鹽析用鹽的選擇在相同離子強度下，鹽的種類對蛋白質溶解度的影響有一定差異，一般的規(guī)律為：半徑小的高價離子的鹽析作用較強，半徑大的低價離子作用較弱（Ks）磷酸鉀>硫酸鈉>硫酸銨>檸檬酸鈉>硫酸鎂鹽析劑的選擇鹽析劑的條件鹽析作用強：鹽析能力—陰離子＞陽離子；高價陰離子＞低價陰離子較大溶解度生物學上是惰性的來源豐富、經(jīng)濟常用鹽析劑—(NH4)2SO4

、Na2SO4、磷酸鹽等影響鹽析的因素無機鹽的種類溶質種類的影響：不同蛋白質所需無機鹽不同溶質濃度的影響：蛋白質濃度大，鹽的用量小，但共沉作用明顯，分辨率低；蛋白質濃度小，鹽的用量大，分辨率高；pH值：影響蛋白質表面凈電荷的數(shù)量通常調(diào)整體系pH值，使其在pI附近；鹽析溫度：一般在高鹽濃度下，溫度升高，其溶解度反而下降鹽析用鹽的用量選擇飽和度（Saturation）的概念：以硫酸銨為例：250C時，硫酸銨的飽和溶解度是767g/L定義為100%飽和度鹽析操作方式及方法操作方式固體鹽加入飽和鹽溶液加入飽和度方法分步鹽析重復鹽析反抽提法鹽析沉淀法的特點

沉淀條件溫和，不會引起生物物質變性失活；非蛋白的雜質夾帶沉淀很少；適用范圍廣；鹽份含量高。

突出的優(yōu)點是：①成本低，不需要特別昂貴的設備。②操作簡單、安全。③對許多生物活性物質具有穩(wěn)定作用。有機溶劑沉淀概念：在含有溶質的水溶液中加入一定量親水的有機溶劑，降低溶質的溶解度，使其沉淀析出。原理：（1）降低了溶質的介電常數(shù)，使溶質之間的靜電引力增加，從而出現(xiàn)聚集現(xiàn)象，導致沉淀。（2）由于有機溶劑的水合作用，降低了自由水的濃度，降低了親水溶質表面水化層的厚度，降低了親水性，導致脫水凝聚。有機溶劑的選擇介電常數(shù)要小對生物分子的變性作用小與水互溶安全、無毒、價廉、易回收等常用的有機溶劑沉析劑乙醇：沉析作用強，揮發(fā)性適中，無毒常用于蛋白質、核酸、多糖等生物大分子的沉析；丙酮：沉析作用更強，用量省，但毒性大，應用范圍不廣；特點：介電常數(shù)小，60%乙醇的介電常數(shù)是48 丙酮的介電常數(shù)是22容易獲取有機溶劑沉淀的特點分辨能力比鹽析法高，即一種蛋白質或其他溶質只在一個比較窄的有機溶劑濃度范圍內(nèi)沉淀。沉淀不用脫鹽，固液分相容易，有機溶劑易祛除易使蛋白質變性失活安全性差成本較高影響有機溶劑沉析的主要因素溫度：大多數(shù)生物大分子如蛋白質、酶和核酸在有機溶劑中對溫度特別敏感，溫度稍高就會引起變性，且有機溶劑與水混合時產(chǎn)生放熱反應，因此有機溶劑必須預先冷至較低溫度，操作要在冰鹽浴中進行，加入有機溶劑時必須緩慢且不斷攪拌以免局部過濃攪拌速度：散熱溶液pH值：有機溶劑沉淀適宜的pH值，要選擇在樣品穩(wěn)定的pH值范圍內(nèi)，而且盡可能選擇樣品溶解度最低的pH值，通常是選在等電點附近，從而提高此沉淀法的分辨能力。原則是避免目標蛋白與雜質帶有相反的電荷，防止共沉現(xiàn)象。離子強度:少量的中性鹽對蛋白質變性有良好的保護作用，但鹽濃度過高會增加蛋白質在水中的溶解度，降低了有機溶劑沉淀蛋白質的效果，通常是在低鹽或低濃度緩沖液中沉淀蛋白質，0.01~0.05mol/L樣品濃度:0.5~2%，

?。喝軇┯昧看螅瑯悠返膿p失較大，回收率低，具有生物活性的樣品易產(chǎn)生稀釋變性。但共沉淀作用小

濃：節(jié)省溶劑用量，減少變性的危險，共沉作用強，分辨率低，分離效果下降，有利于提高分離效果。金屬離子的助沉析作用：Zn2+、Ca2+等電點沉淀原理： 蛋白質是兩性電解質，當溶液pH值處于等電點時，分子表面凈電荷為0，雙電層和水化膜結構被破壞，由于分子間引力，形成蛋白質聚集體，進而產(chǎn)生沉淀。概念：

利用兩性生物物質在等電點時溶解度最小而析出固相物的過程特點1.沉淀條件溫和；2.不引入新的物質；3.沉淀效果差。由于許多蛋白質的等電點十分接近，而且?guī)в兴さ牡鞍踪|等生物大分子仍有一定的溶解度，不能完全沉淀析出，因此，單獨使用此法分辨率較低，效果不理想，因而此法常與鹽析法、有機溶劑沉淀法或其他沉淀劑一起配合使用，以提高沉淀能力和分離效果。此法主要用于在分離純化流程中去除雜蛋白，而不用于沉淀目的物成鹽類復合物沉析劑此類沉析劑有以下三種：（1）高價金屬鹽：Cu2+，Ag2+，Zn2+，Ca2+ 與酸性基團結合；（2）苦味酸鹽、單寧酸鹽、鞣質等，與堿性基 團結合（3）無機復合鹽：磷鎢酸鹽、磷鉬酸鹽等缺點：容易導致活性蛋白的不可逆變性特點沉淀效果很好；容易使生物分子變性復合物難分解高分子聚合物沉淀法定義—利用一些水溶性高分子聚合物使目的物溶解度降低而析出固相物的過程有機聚合物是六十年代發(fā)展起來的一類重要的沉淀劑，最早應用于提純免疫球蛋白和沉淀一些細菌和病毒。近年來廣泛用于核酸和酶的純化。應用最多的是聚乙二醇（PEG)，它的親水性強，溶干水和許多有機溶劑，對熱穩(wěn)定，有廣泛圍的分子量，在生物大分子制備中，用的較多的是分子量為6000～20000的PEG。

特點沉淀效果較好，使用很少量的PEG即可以沉淀相當多的生物大分子，條件溫和高聚物的殘留有一定的毒性（陽離子）沉淀機理①沉淀作用是聚合物與生物大分子發(fā)生共沉淀作用。②由于聚合物有較強的親水性，使生物大分子脫水而發(fā)生沉淀③聚合物與生物大分子之間以氫鍵相互作用形成復合物，在重力作用下形成沉淀析出。

離子型表面活性劑十六烷基三甲基季銨鹽的溴化物（CTAB） 主要用于沉淀酸性多糖十二烷基磺酸鈉（SDS） 主要用于沉淀膜蛋白和核蛋白結晶的概念溶液中的溶質在一定條件下，因分子有規(guī)則的排列而結合成晶體，晶體的化學成分均一，具有各種對稱的晶體，其特征為離子和分子在空間晶格的結點上呈規(guī)則的排列固體有結晶和無定形兩種狀態(tài)結晶析出速度慢，溶質分子有足夠時間進行排列，粒子排列有規(guī)則無定形固體析出速度快，粒子排列無規(guī)則結晶操作的特點只有同類分子或離子才能排列成晶體，因此結晶過程有良好的選擇性。通過結晶，溶液中大部分的雜質會留在母液中，再通過過濾、洗滌，可以得到純度較高的晶體。結晶過程具有成本低、設備簡單、操作方便，廣泛應用于氨基酸、有機酸、抗生素、維生素、核酸等產(chǎn)品的精制。結晶過程分析——幾個概念飽和溶液：當溶液中溶質濃度等于該溶質在同等條件下的飽和溶解度時，該溶液稱為飽和溶液；過飽和溶液：溶質濃度超過飽和溶解度時，該溶液稱之為過飽和溶液；溶質只有在過飽和溶液中才能析出；結晶過程的實質結晶是指溶質自動從過飽和溶液中析出，形成新相的過程這一過程包括：溶質分子凝聚成固體分子有規(guī)律地排列在一定晶格中這一過程與表面分子化學鍵力變化有關；因此，結晶過程是一個表面化學反應過程。結晶的步驟過飽和溶液的形成晶核的形成晶體生長其中，溶液達到過飽和狀態(tài)是結晶的前提；過飽和度是結晶的推動力。過飽和溶液的形成

蒸發(fā)法溫度誘導法鹽析法這是生化制藥中應用最多的結晶方法。其作用是通過向結晶溶液中引入中性鹽，逐漸降低溶質的溶解度使其過飽和，經(jīng)過一定時間后晶體形成并逐漸長大。4.透析法5.有機溶劑結晶法6.等電點法7.微量擴散法8.化學反應結晶法

9.共沸蒸餾結晶提高晶體質量的方法晶體質量包括三個方面的內(nèi)容： 晶體大小、形狀和純度影響晶體大小的因素： 過飽和度、溫度、晶核質量、攪拌等影響晶體形狀的因素： 改變過飽和度、改變?nèi)軇w系、雜質影響晶體純度的因素：母液中的雜質、結晶速度、晶體粒度及粒度分布晶體結塊晶體結塊是一種導致結晶產(chǎn)品品質劣化的現(xiàn)象，導致晶體結塊的主要原因有：結晶理論：由于某些原因造成晶體表面溶解并重結晶，使晶粒之間在接觸點上形成固體晶橋，呈現(xiàn)結塊現(xiàn)象；毛細管吸附理論：由于晶體間或晶體內(nèi)的毛細管結構，水分在晶體內(nèi)擴散，導致部分晶體的溶解和移動，為晶粒間晶橋的形成提供飽和溶液，導致晶體結塊。重結晶經(jīng)過一次粗結晶后，得到的晶體通常會含有一定量的雜質。此時