色譜分離技術(shù)的演變和發(fā)展作者：鄭組員：胡畢姚譚實(shí)驗(yàn)前討論：(1)什么是色譜分離技術(shù)？它經(jīng)歷怎樣的發(fā)展、演變過程？

(2)簡要說明色譜分析方法的基本原理，固定相和流動相的作用分別是什么？

(3)柱色譜的色譜柱如何進(jìn)行填充？填充過程中需要注意哪些問題？

(4)簡述柱色譜常用的洗脫劑及其洗脫能力的次序，如何選擇合適的洗脫劑？采用柱色譜分離甲基橙和次甲基藍(lán)混合染料時，為什么先用95%乙醇溶液作為洗脫劑，再用去離子水做洗脫劑進(jìn)行洗脫，如果兩者換一下次序是否可以？為什么？

什么是色譜分離技術(shù)?色譜分離技術(shù)又稱層析分離技術(shù)或色層分離技術(shù)，是一種分離復(fù)雜混合物中各個組分的有效方法。它是利用不同物質(zhì)在由固定相和流動相構(gòu)成的體系中具有不同的分配系數(shù)，當(dāng)兩相作相對運(yùn)動時，這些物質(zhì)隨流動相一起運(yùn)動，并在兩相間進(jìn)行反復(fù)多次的分配，從而使各物質(zhì)達(dá)到分離。色譜技術(shù)的發(fā)展和演變1色譜的起源2分配色譜的出現(xiàn)和色譜方法的普及3氣相色譜和色譜理論的出現(xiàn)4高效液相色譜將一滴含有混合色素的溶液滴在一塊布或紙片上,隨著溶液展開可以觀察到一個個同心圓環(huán)出現(xiàn)，古代羅馬人就是用這種簡單方法來分析燃料與色素。大約在100多年前，德國化學(xué)家Runge對該方法做了重要改進(jìn)，使其有更好的重現(xiàn)性和定量能力。這項(xiàng)技術(shù)后來就發(fā)展成了今天的紙上色譜技術(shù)。到了20世紀(jì)初,1906年俄國植物學(xué)家米哈伊爾.茨維特用碳酸鈣填充豎立的玻璃管,以石油醚洗脫植物色素的提取液,一段時間后,植物色素在碳酸鈣柱中分離,以一條色帶分散為數(shù)條平行的色帶,這一實(shí)驗(yàn)將混合的色素分離為不同的色帶,因此茨維特將這一方法命名為色普法（Chromatography）,色譜分離法創(chuàng)立時沒有引起人們的注意，直到30年代后才被廣泛使用。起源分配色譜的出現(xiàn)和色譜方法的普及1938年阿切爾?約翰?波特?馬丁和理查德?勞倫斯?米林頓?辛格準(zhǔn)備利用氨基酸在水和有機(jī)溶劑中的溶解度差異分離不同種類的氨基酸，馬丁早期曾經(jīng)設(shè)計了逆流萃取系統(tǒng)以分離維生素，馬丁和辛格準(zhǔn)備用兩種逆向流動的溶劑分離氨基酸，但是沒有獲得成功。后來他們將水吸附在固相的硅膠上，以氯仿沖洗，成功地分離了氨基酸，這就是現(xiàn)在常用的分配色譜。在獲得成功之后，馬丁和辛格的方法被廣泛應(yīng)用于各種有機(jī)物的分離。1943年馬丁以及辛格又發(fā)明了在蒸汽飽和環(huán)境下進(jìn)行的紙色譜法。氣相色譜和色譜理論的出現(xiàn)1952年馬丁和詹姆斯提出用氣體作為流動相進(jìn)行色譜分離的想法，他們用硅藻土吸附的硅酮油作為固定相，用氮?dú)庾鳛榱鲃酉喾蛛x若干種小分子量揮發(fā)性有機(jī)酸。氣相色譜的出現(xiàn)使色譜技術(shù)從最初的定性分離手段進(jìn)一步演化為具有分離功能的定量測定手段，并且極大的刺激了色譜技術(shù)和理論的發(fā)展。相比于早期的液相色譜，以氣體為流動相的色譜對設(shè)備的要求更高，這促進(jìn)了色譜技術(shù)的機(jī)械化、標(biāo)準(zhǔn)化和自動化；氣相色譜需要特殊和更靈敏的檢測裝置，這促進(jìn)了檢測器的開發(fā)；而氣相色譜的標(biāo)準(zhǔn)化又使得色譜學(xué)理論得以形成色譜學(xué)理論中有著重要地位的塔板理論和VanDeemter方程，以及保留時間、保留指數(shù)、峰寬等概念都是在研究氣相色譜行為的過程中形成的。高效液相色譜1960年代，為了分離蛋白質(zhì)、核酸等不易汽化的大分子物質(zhì)，氣相色譜的理論和方法被重新引入經(jīng)典液相色譜。1960年代末科克蘭、哈伯、荷瓦斯、莆黑斯、里普斯克等人開發(fā)了世界上第一臺高效液相色譜儀，開啟了高效液相色譜的時代。高效液相色譜使用粒徑更細(xì)的固定相填充色譜柱，提高色譜柱的塔板數(shù)，以高壓驅(qū)動流動相，使得經(jīng)典液相色譜需要數(shù)日乃至數(shù)月完成的分離工作得以在幾個小時甚至幾十分鐘內(nèi)完成。1971年科克蘭等人出版了《液相色譜的現(xiàn)代實(shí)踐》一書，標(biāo)志著高效液相色譜法(HPLC)正式建立。在此后的時間里，高效液相色譜成為最為常用的分離和檢測手段，在有機(jī)化學(xué)、生物化學(xué)、醫(yī)學(xué)、藥物開發(fā)與檢測、化工、食品科學(xué)、環(huán)境監(jiān)測、商檢和法檢等方面都有廣泛的應(yīng)用。高效液相色譜同時還極大的刺激了固定相材料、檢測技術(shù)、數(shù)據(jù)處理技術(shù)以及色譜理論的發(fā)展。固定相和流動相的作用固定相指色譜過程中不移動的具有吸附活性的固體，柱色譜和平板色譜中既起分離作用又不移動的那一項(xiàng)（如茨維特實(shí)驗(yàn)中細(xì)粒狀碳酸鈣）或是涂漬在載體表面上的液體（稱固定液）。流動相是指色譜分析過程中攜帶組分向前移動的物質(zhì)，與固定相處于平衡狀態(tài)，帶動樣品進(jìn)行移動的那一項(xiàng)（如茨維特實(shí)驗(yàn)中石油醚）。柱色譜中色譜柱的填充干法

裝柱將吸附劑一次加入色譜柱，振動管壁使其均勻下沉，然后沿管壁緩緩加入洗脫劑；或在色譜柱下端出口處連接活塞，加入適量的洗脫劑，旋開活塞使洗脫劑緩緩滴出，然后自管頂緩緩加入吸附劑，使其均勻地潤濕下沉，在管內(nèi)形成松緊適度的吸附層。操作過程中應(yīng)保持有充分的洗脫劑留在吸附層的上面。濕法裝柱將吸附劑與洗脫劑混合，攪拌除去空氣泡，徐徐傾入色譜柱中，然后加入洗脫劑將附著管壁的吸附劑洗下，使色譜柱面平整。等到填裝吸附劑所用洗脫劑從色譜柱自然流下，液面和柱表面相平時，即加供試品液。柱色譜填充注意事項(xiàng)干法操作時應(yīng)保持有充分的洗脫劑留在吸附層的上面。濕法等到填裝吸附劑所用洗脫劑從色譜柱自然流下，液面和柱表面相平時，即可加供試品溶液。柱色譜常用的洗脫劑及其洗脫能力的次序，如何選擇合適的洗脫劑？洗脫劑的洗脫能力有如下(極性)順序：

己烷和石油醚＜環(huán)己烷＜四氯化碳＜三氯乙烯＜二硫化碳＜甲苯＜苯＜二氯甲烷＜氯仿＜乙醚＜乙酸乙酯＜丙酮＜丙醇＜乙醇＜甲醇＜水＜吡啶＜乙酸選擇的洗脫劑極性不能大于樣品中各組分的極性。否則樣品組分在柱色譜中移動過快，不能建立吸附-洗脫平衡，影響分離效果。實(shí)際操作時，一般采用薄層色譜反復(fù)對比、選擇柱色譜的洗脫劑。能在薄層色譜上將樣品中各組分完全分開，即可作柱色譜洗脫劑。一般來說，洗脫劑都需要采用混合溶劑，利用強(qiáng)極性和弱極性溶劑復(fù)配而成。

采用柱色譜分離甲基橙和次甲基藍(lán)混合染料時，為什么先用95%乙醇溶液作為洗脫劑，再用去離子水做洗脫劑進(jìn)行洗脫，如果兩者換一下次序是否可以？為什么？不可以,因?yàn)榇渭谆{(lán)可溶于乙醇,而甲基橙不溶于乙醇等有機(jī)溶劑,先用95%乙醇溶液洗脫可以使二者分離,而次甲基藍(lán)和甲基橙都可溶于去離子水,使之充分溶解.兩者次序不可以交換,因?yàn)槿粝仁褂萌ルx子水,甲基橙和次甲基藍(lán)都充分溶解,難以再進(jìn)行分離.由于甲基橙和亞甲基藍(lán)結(jié)構(gòu)不同，極性也不同,根據(jù)相似相容原理,吸附劑對它們的吸附能力也不同,洗脫劑對他們的解析速度也不同,極性小吸附能力弱,解析速度快的次甲基藍(lán)先被洗脫下來,而極性大,吸附能力強(qiáng)的,解析速度慢的甲基橙后被洗脫下來,從而使兩種物質(zhì)得以洗脫下來,本實(shí)驗(yàn)以氧化鋁做為吸附劑,對于極性洗脫劑:去離子水大于95%的乙醇溶液,如果極性過大的話有可能,被一起洗脫下來實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?/p>

學(xué)習(xí)色譜法分離和鑒定化合物的原理和基本操作了解和掌握薄層吸附色譜展開劑、柱色譜中洗脫劑、植物色素的提取和分離試劑的選擇原則。實(shí)驗(yàn)原理：層析分離是利用混合物的各組份隨著流動的液體或氣體（稱流動相）通過另一種固定不動的固體或液體（稱固定相）時，在兩相中分配（選擇性溶解）、吸附或其他親和性能的差別，達(dá)到分離的目的。

實(shí)驗(yàn)原理:菠菜的葉片中含有葉綠素（包括葉綠素a和葉綠素b）、葉黃素及胡蘿卜素等天然色素?？捎帽崛　Ｌ崛?葉綠素易溶于無水乙醇等有機(jī)溶劑中,可以用無水乙醇提取綠葉中的葉綠體色素.分離:不同葉綠體色素隨層析液在濾紙上擴(kuò)散速度不同,從而分離出來形成條帶.實(shí)驗(yàn)材料:材料:新鮮綠葉(如菠菜綠葉),石油醚、丙酮、乙醇、碳酸鈣用具:烘箱、紙層析濾紙、表面皿、培養(yǎng)皿、研缽、離心機(jī)等實(shí)驗(yàn)步驟:葉綠素的提取1取新鮮植物葉片(如菠菜葉)，用烘箱(48℃)烘干半個小時，研成粉末（加入少量碳酸鈣）。取葉粉(約2g)放入小燒杯中，加入適量乙醇(約20-30毫升)，進(jìn)行浸提。浸提過程中需用玻棒經(jīng)常攪動，如氣溫過低亦可適當(dāng)加熱，待酒精呈深綠色時，將溶液過濾到另一燒杯或三角瓶中置暗中備用。2取少量浸提液用臺式離心機(jī)3000轉(zhuǎn)/分，離心2分鐘，保留上清液（含有葉綠素）。實(shí)驗(yàn)步驟:3點(diǎn)樣取準(zhǔn)備好的濾紙條（2×20cm），將其一端剪去兩側(cè)，中間留一長約1.5cm，寬約0.5cm的窄條，并在濾紙剪口上方折疊出一條直線，作為畫提取液細(xì)線的基準(zhǔn)線。用毛細(xì)吸管沾少許濾液在折線上描繪4~5次。

實(shí)驗(yàn)步驟:4展開:將適量的層析液（分離液）倒入燒杯，將濾紙條畫線一端朝下，輕輕插入層析液中，迅速用培養(yǎng)皿蓋住燒杯。

無水乙醇作為溶劑提??；若考慮分離色素，最早的色素分離是采用硅膠，若用乙醇顯然效果不好。而采用LH-20等材料，分離效果很好。聚酰胺等等5觀察記錄：待層析液上緣擴(kuò)散至接近濾紙條頂端時，將濾紙條取出，風(fēng)干。觀察濾紙條上所出現(xiàn)的色素帶及其顏色，并做好記錄。

最后濾紙條上將分離出四條色素帶，顏色從上往下分別是橙黃色、黃色、藍(lán)綠色和黃綠色，四種色素分別是胡蘿卜素、葉黃素、葉綠素a和葉綠素b。形成原因：層析液通過毛細(xì)作用擴(kuò)散到色素線上時將色素溶解在層析液中，它們的溶解度是不一樣的，層析液在紙上繼續(xù)向前擴(kuò)散的時候，會不斷揮發(fā)，因此其溶劑量會不斷減少，那么溶解度低的色素就會首先被析出呈現(xiàn)在紙上，而溶解度高的隨著層析液繼續(xù)往前擴(kuò)散，在前面一點(diǎn)的地方析出。

至于為什么不會在相隔的兩條帶之間有色素，是因?yàn)閷游鲆菏蔷徛郎p少的，而每一種色素其析出的濃度只有一個，所以只會形成一條帶。而胡蘿卜素會在最上方,是因?yàn)橄嗨葡嗳菰?胡蘿卜素與石油醚的極性最相近,因此胡蘿卜素在石油醚中溶解度最大,因此