李江華江南大學(xué)2014-9-19新型有機(jī)酸的發(fā)酵法制備技術(shù)報告內(nèi)容

一.新型有機(jī)酸概況二.新型有機(jī)酸發(fā)酵研究進(jìn)展舉例丙酮酸發(fā)酵丙酸發(fā)酵

α-酮戊二酸發(fā)酵三.新型有機(jī)酸發(fā)酵工業(yè)展望一、新型有機(jī)酸概況

新型有機(jī)酸概述檸檬酸乳酸α-酮戊二酸丙酸琥珀酸衣康酸葡萄糖酸丙酮酸有機(jī)酸是指一些具有酸性的有機(jī)化合物。最常見的有機(jī)酸是羧酸，其酸性源于羧基

(-COOH)新型有機(jī)酸概述新型有機(jī)酸是指一系列在食品、醫(yī)藥和化工等領(lǐng)域具有重要應(yīng)用價值，但是長期以來由于結(jié)構(gòu)復(fù)雜性和較高的化學(xué)反應(yīng)活性無法在工業(yè)規(guī)模進(jìn)行低成本生產(chǎn)的有機(jī)酸。其中丙酮酸、-酮戊二酸和丙酸等，由于化學(xué)合成工藝復(fù)雜，成本長期維持在10萬元/噸以上(普通有機(jī)酸價格僅為0.4-1萬元/噸)，導(dǎo)致下游產(chǎn)品成本居高不下，妨礙了其大規(guī)模應(yīng)用。二.新型有機(jī)酸發(fā)酵研究進(jìn)展－丙酮酸丙酮酸的應(yīng)用領(lǐng)域丙酮酸農(nóng)業(yè)：阿托酸、谷物保護(hù)劑等多種農(nóng)藥合成前體食品工業(yè)：

功能飲料添加劑

減肥食品酸味劑醫(yī)藥工業(yè)：原料藥藥物合成前體藥物佐劑日化工業(yè)：防腐劑抗氧化劑診斷檢測試劑：伯醇/仲醇檢定轉(zhuǎn)氨酶測定脂肪族胺顯示劑丙酮酸的生產(chǎn)方式比較化學(xué)法代謝工程改造：酶轉(zhuǎn)化法發(fā)酵法篩選得到的菌種：光滑球擬酵母釀酒酵母大腸桿菌原料成本高環(huán)境污染嚴(yán)重原料成本高來源有限最適pH值高易感染噬菌體丙酮酸耐受性差轉(zhuǎn)化率較低，副產(chǎn)物多生產(chǎn)周期較長發(fā)酵過程不穩(wěn)定最適pH值低不易染菌無噬菌體高丙酮酸耐受性發(fā)酵法生產(chǎn)丙酮酸GlucosePyruvateGlucosePyruvateAlanineAcetaldehydeEthanolCitrateOAA-KGAcCoAPyruvateOAAPDH(B1,NA)PDC(B1)PT(B6)PC(Bio)B1：硫胺素NA：煙酸Bio：生物素B6：吡哆醛

30

60

90

120

2

4

6

8

0.01

0.02

0.03

0.04

0.1

0.2

0.3

0.4

0.01

0.02

0.03

0.04

0

0.2

0.4

0.6

0.8

0

0

0.05

0.1

0.15

10

20

30

40

50

0

20

40

60

80

0

丙酮酸

/g×L-1

0

0

0

0

150

煙酸

/mg×L-1

硫胺素

/mg×L-1

吡哆醇

/mg×L-1

生物素

/mg×L-1

核黃素

/mg×L-1

葡萄糖消耗

/g×L-1

細(xì)胞生長

/OD660

丙酮酸產(chǎn)率

/g×g-1

選育維生素缺陷型酵母光滑球擬酵母丙酮酸代謝優(yōu)化培養(yǎng)基中維生素供給XXXX菌株選育不同kLa下發(fā)酵動力學(xué)曲線不同kLa下溶氧、產(chǎn)率變化ConstantkLa

/h-1Parameters450300200r

(IG)/(g/L)118.6119.4124.8r

(RG)/(g/L)

11.9

13.2

6.4Totalfermentationtime/h

85

68

60Glucoseconsumptionrate/(g/(L?h))1.141.561.97w

(Glucoseconversion)/%

90.0

88.9

94.9r

(Pyruvate)/(g/L)

77.3

69.0

57.2Productivity/(g/(L?h))

0.91

1.01

0.95Yp/s

/(g/g)0.7240.6490.483d

(DCW)/(g/L)

13.2

14.5

15.6Averagem

ofthefirst16h/h-1

0.238

0.190

0.139Averagem

oftheprocess/h-1

0.047

0.073

0.084r

(NH4Clconsumption)/(g/L)

5.66

5.88

6.06r

(KH2PO4

consumtion)/(g/L)

1.35

1.23

1.12r

(Ethanol)/(g/L)

1.34

1.55

1.67不同供氧控制模式下發(fā)酵過程參數(shù)高溶氧下，丙酮酸產(chǎn)率較高(0.724g/g)，葡萄糖消耗速度(生產(chǎn)強(qiáng)度)較慢(1.14g/(Lh))低溶氧下，細(xì)胞消耗葡萄糖速度加快(1.97g/(Lh))，丙酮酸產(chǎn)率(0.483g/g)卻明顯下降不同供氧控制模式下發(fā)酵過程參數(shù)丙酮酸產(chǎn)率細(xì)胞產(chǎn)率發(fā)酵法生產(chǎn)丙酮酸代謝網(wǎng)絡(luò)分析DO=10%DO=85%高溶氧下轉(zhuǎn)化率高的原因:DO從85%到10%，PEP到Pyr的通量增加了20%，丙酮酸代謝的通量下降了63.3%輔因子分析低溶氧下生產(chǎn)強(qiáng)度提高原因：DO從85%到10%，總ATP、NADH下降31.4%、18.6%，糖耗速度上升59%總ATP下降31.4%,NADH下降18.6%生產(chǎn)強(qiáng)度(糖耗速度)DO=10%DO=85%采用單一供氧模式(高或低)，不能同時達(dá)到高轉(zhuǎn)化率和高生產(chǎn)強(qiáng)度發(fā)酵法生產(chǎn)丙酮酸實現(xiàn)相對統(tǒng)一高產(chǎn)量(69.4g/L)高產(chǎn)率(0.636g/g)高生產(chǎn)強(qiáng)度(1.95g/(Lh))

分階段供氧模式發(fā)酵0-16h控制kLa為450h-1發(fā)酵16h后將kLa降低至200h-1發(fā)酵過程碳平衡分析前16h較高溶氧有利于碳流合成細(xì)胞；16h后耗氧速率恒定，碳流轉(zhuǎn)向合成丙酮酸必須進(jìn)行分階段溶氧控制！如何分階段？發(fā)酵法生產(chǎn)丙酮酸美國科學(xué)院院士LO.Ingram在PNAS上的論文11次引用本團(tuán)隊丙酮酸高效合成的論文，并比較表明本團(tuán)隊獲得了國際最高發(fā)酵水平。

2篇有關(guān)丙酮酸發(fā)酵微生物生理特性和優(yōu)化技術(shù)的博士論文2009、2011年分別獲發(fā)酵工程領(lǐng)域至今唯一的兩篇全國優(yōu)秀博士論文被世界上最大發(fā)酵公司之一日本味之素公司購買，為該公司從中國購買的唯一技術(shù)發(fā)酵法生產(chǎn)丙酮酸二.新型有機(jī)酸發(fā)酵研究進(jìn)展－丙酸丙酸的應(yīng)用及市場2012:260mlbs(117,936tonnes)化學(xué)法：2萬/噸發(fā)酵法：6萬/噸（食品安全）丙酸鈣價格06年全球產(chǎn)量37.7萬噸75%用于谷物和飼料防腐消費(fèi)者熱衷于使用天然、綠色、健康的發(fā)酵級丙酸鈣作為食品防腐劑化學(xué)合成法微生物發(fā)酵法烴氧化法、乙烯羰基化法食品安全問題原料廉價、可再生過程綠色、環(huán)保環(huán)境污染嚴(yán)重資源不可再生微生物發(fā)酵法——低碳、環(huán)保、綠色、安全!丙酸的生產(chǎn)方法丙酸桿菌代謝工程改造策略過量表達(dá)甘油脫氫酶（gldA），提高對甘油的利用速率過量表達(dá)蘋果酸脫氫酶（mdh），富馬酸水合酶（fumC），提高丙酸代謝途徑通量gldAmdhfumC丙酸發(fā)酵的問題丙酸桿菌對碳源利用率低，生長慢；代謝途徑過程中存在若干限速酶，大大抑制了丙酸的積累篩選丙酸高產(chǎn)菌從奶制品廠取樣低丙酸濃度富集高丙酸濃度初篩產(chǎn)量檢測復(fù)篩242529303236菌種鑒定篩選野生型質(zhì)粒細(xì)胞壁裂解條件優(yōu)化

Blank12345678Lysozyme00.500.50.51110ProteinaseK000.50.510.5101Result---++++--條件:溶菌酶20mg/mL37oC,蛋白酶K2mg/mL56oC.“-”表示細(xì)胞壁沒有裂解.“+”表示細(xì)胞壁被裂解.菌種是否含有質(zhì)粒P.a×25×32√29×30×24×36×質(zhì)粒電泳圖質(zhì)粒鑒定分析質(zhì)粒ORF轉(zhuǎn)錄水平分析丙酸高產(chǎn)菌、野生質(zhì)粒的篩選以及質(zhì)粒分析過量表達(dá)甘油脫氫酶電轉(zhuǎn)化241000菌落PCR菌種鑒定Marker100012Marker151110001235371000Marker100012野生菌與工程菌分批發(fā)酵對比△:丙酸(PA),□:甘油濃度,▲:細(xì)胞干重(DCW),■:乙酸(AA),◆:琥珀酸(SA),?:甘油脫氫酶比酶活.2929(pZGX03-gldA)菌株P(guān)A(g/L)YP/S(g/g)YP/A(g/g)rPA/Glycerol(g/g)生產(chǎn)強(qiáng)度(gL-1h-1)2922.0614.618.20.730.1529(pZGX03-gldA)28.23239.080.9410.20過量表達(dá)甘油脫氫酶工程菌的丙酸產(chǎn)量比野生菌提高了28%過量表達(dá)丙酸代謝限速酶GenomeofKlebsiellapneumoniaeBluntingligationBluntingligationmdhfumCP.jenseniiATCC4868(pZGX04-fumC)和P.jenseniiATCC4868(pZGX04-mdh)分批補(bǔ)料發(fā)酵□,glycerol;△,PA;▲,LA;■,DCW;◆,AA.富馬酸水合酶基因和蘋果酸脫氫酶基因表達(dá)載體的構(gòu)建過量表達(dá)丙酸代謝限速酶菌株周期(h)DCW(g/L)副產(chǎn)物(g/L)生產(chǎn)強(qiáng)度(g?L-1?h-1)提高(%)丙酸乳酸乙酸P.jenseniiATCC48682283.6526.952.722.410.118-P.jenseniiATCC4868(pZGX04-gldA)2283.4134.622.862.600.15228.46P.jenseniiATCC4868(pZGX04-fumC)2283.3434.522.832.570.15628.09P.jenseniiATCC4868(pZGX04-mdh)2283.3536.092.702.510.16433.91不同菌株丙酸發(fā)酵參數(shù)對比過量表達(dá)甘油脫氫酶基因的工程菌丙酸產(chǎn)量比出發(fā)菌提高了28.46%過量表達(dá)富馬酸水合酶基因的工程菌丙酸產(chǎn)量比出發(fā)菌提高了28.09%過量表達(dá)蘋果酸脫氫酶基因的工程菌丙酸產(chǎn)量比出發(fā)菌提高了33.91%共表達(dá)關(guān)鍵限速酶mdh-fumCElectrotransformation富馬酸水合酶基因和蘋果酸脫氫酶基因共表達(dá)載體的構(gòu)建示意圖三株共表達(dá)載體pZGX04-gldA-mdh,pZGX04-gldA-fumC,pZGX04-mdh-fumC的物理圖譜共表達(dá)關(guān)鍵限速酶不同菌株丙酸分批發(fā)酵參數(shù)對比共表達(dá)蘋果酸脫氫酶和富馬酸水合酶基因的工程菌丙酸產(chǎn)量比出發(fā)菌提高了36.73%共表達(dá)甘油脫氫酶和富馬酸水合酶基因的工程菌丙酸產(chǎn)量比出發(fā)菌提高了39.22%共表達(dá)甘油脫氫酶和蘋果酸脫氫酶基因的工程菌丙酸產(chǎn)量比出發(fā)菌提高了46.31%菌株周期(h)DCW(g/L)副產(chǎn)物(g/L)生產(chǎn)強(qiáng)度(g?L-1?h-1)提高(%)丙酸乳酸乙酸P.jenseniiATCC48682283.6526.952.722.410.118-P.jenseniiATCC4868(pZGX04-mdh-fumC)2283.1636.852.652.330.16236.73P.jenseniiATCC4868(pZGX04-gldA-fumC)2283.2637.522.852.510.16539.22P.jenseniiATCC4868(pZGX04-gldA-mdh)2283.2839.432.742.550.17346.31氧化還原電位（ORP）發(fā)酵優(yōu)化不控制ORP分批發(fā)酵□,甘油;△,丙酸;○,pH;▲,乳酸;■,DCW;◆,乙酸;

，ORP.不控制ORP發(fā)酵，ORP下降迅速，后期產(chǎn)酸能力低氧化還原電位（ORP）發(fā)酵優(yōu)化不同ORP對分批發(fā)酵的影響□,甘油;△,丙酸;○,pH;▲,乳酸;■,DCW;◆,乙酸高ORP條件下，菌體濃度高；低ORP條件下，單位菌體產(chǎn)酸能力高氧化還原電位（ORP）發(fā)酵優(yōu)化三階段ORP控制對分批發(fā)酵的影響□,甘油;△,丙酸;○,pH;▲,乳酸;■,DCW;◆,乙酸提出三階段ORP控制策略：0-36h，控制ORP為-200mV；36-156h，控制ORP為350mV，156h后控制ORP為-400mV。三階段ORP控制分批發(fā)酵丙酸產(chǎn)量比不控制ORP發(fā)酵提高了27.7%10m3發(fā)酵罐放大試驗丙酸10m3罐中試發(fā)酵過程曲線—□—residualglycerol,—△—PA,—■—DCW,—▲—SA,—*—AA丙酸最高產(chǎn)量為47.28g/L，生產(chǎn)強(qiáng)度為0.197g·L-1h-1全球第二家采用發(fā)酵法生產(chǎn)丙酸二.新型有機(jī)酸發(fā)酵研究進(jìn)展－α-酮戊二酸

-酮戊二酸的應(yīng)用降低病患機(jī)體損耗清除自由基，延緩衰老提高繁殖率，促進(jìn)骨骼的生長有機(jī)中間體體格增強(qiáng)劑、運(yùn)動飲料添加劑醫(yī)藥化妝品食品化工飼料

-酮戊二酸市場概況國際市場食品級-酮戊二酸潛在市場容量約為1萬噸

名稱價格(RMB/Kg)純度用途-酮戊二酸28098%醫(yī)藥、化工中間體L-精氨酸：-酮戊二酸鈉鹽(2:1)35099%運(yùn)動飲料添加劑L-鳥氨酸：-酮戊二酸鈉鹽(1:1)65099%運(yùn)動飲料添加劑化學(xué)法發(fā)酵法篩選得到的菌種：解脂亞諾酵母

-酮戊二酸的生產(chǎn)方法生產(chǎn)效率低、環(huán)境非友好和有毒試劑使用，限制其在醫(yī)藥、保健品和食品等高附加值產(chǎn)品生產(chǎn)應(yīng)用生產(chǎn)效率高環(huán)境友好食品安全性高食品安全級生物法生產(chǎn)-酮戊二酸土壤樣品維生素B1缺陷型篩選500株微生物菌株0.1g/L13.4%0.1-1g/L74.4%1-10g/L6.4%10g/L5.8%菌落形態(tài)AGTCTAGTATAAACAATTATACAGTGAAACTGCGAACGGCTCATTAAATCAGTTATCGTTTATTTGATAGTTTTCTACATGGATAACCGTGATAACTTCAGAACTAATACATGACAGCCTTCTGGCGTATATATTAGATACAAACCAACAGTATGGTGATTCATAATATCTTGTCGAACCGATCTTCGGTGTATCATTCAAATTTCTGCCCTATCAACTGTCGATGGTAGGATCGTGGCCTACCATGGTAACAACGGGTAACGGGGAATCAGGGTTCTATTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAAACGGCTACCACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCCTGACACAGGGAGGTAGTGACAATATATAACGATCCGGGGCTCTTTGAGTTTCGGAATTGGAATGAGTACAATTTAAACACCTTAACGAGGAACAATTGGAGGGCAAGTCTG18SrRNAYarrowialipolyticaWSH-Z06生物法生產(chǎn)-酮戊二酸的關(guān)鍵問題當(dāng)以甘油為唯一碳源時，發(fā)酵6天后-KG產(chǎn)量可達(dá)30g/L左右，但是發(fā)酵液中同時會積累大量的副產(chǎn)物—丙酮酸(30g/L左右)。Y.lipolyticaWSH-Z06搖瓶發(fā)酵曲線-KG(■),Glycerol(●),Pyruvate(▲),DCW(▼)

存在的問題1.輔因子調(diào)控3.節(jié)流2.開源4.調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白解決方案——代謝工程改造解脂亞洛酵母代謝工程改造解脂亞洛酵母1.輔因子調(diào)控調(diào)控乙酰輔酶A代謝促進(jìn)-酮戊二酸的積累CONACS1/ACLCONACS1ACL過量表達(dá)ACS1基因使胞內(nèi)ACS比酶活達(dá)到0.92U/mgprotein，過量表達(dá)ACL基因使胞內(nèi)ACL酶活達(dá)到了1.51U/mgprotein，比對照分別提高了10.5和11.6倍，胞內(nèi)乙酰輔酶A含量分別是對照的231.2%和244.2%。調(diào)控乙酰輔酶A代謝促進(jìn)-酮戊二酸的積累過量表達(dá)ACS1和ACL基因?qū)w生長和-酮戊二酸合成的影響■:-KG;●:Glycerol;▲:pyruvate;▼:DCW(A):Thetime-coursesoffermentationinY.lipolytica-CON;(B):Thetime-coursesoffermentationinY.lipolytica-ACS1;(C):Thetime-coursesoffermentationinY.lipolytica-ACL.提高16.2%提高28.6%Y.lipolytica-ACS1和Y.lipolytica-ACL中-酮戊二酸的產(chǎn)量分別為42.2g/L和46.7g/L，比對照菌(36.3g/L)分別提高了16.2%和28.6%。丙酮酸產(chǎn)量分別為14.5g/L和10.6g/L，比對照菌(21.2g/L)分別降低了31.6%和50%。代謝工程改造解脂亞洛酵母2.開源強(qiáng)化丙酮酸羧化途徑促進(jìn)-酮戊二酸的積累6.5倍10.2倍CONScPYC1RoPYC2表達(dá)載體p0(hph)-ScPYC1和p0(hph)-RoPYC2的構(gòu)建Y.lipolytica及其突變株胞內(nèi)PC酶活轉(zhuǎn)化子提取基因組進(jìn)行PCR驗證強(qiáng)化丙酮酸羧化途徑促進(jìn)-酮戊二酸的積累過量表達(dá)ScPYC1和RoPYC2基因?qū)w生長和-酮戊二酸合成的影響■:-KG;●:Glycerol;▲:Pyruvate;▼:DCW(A):Thetime-coursesoffermentationinY.lipolytica-CON;(B):Thetime-coursesoffermentationinY.lipolytica-ScPYC1;(C):Thetime-coursesoffermentationinY.lipolytica-RoPYC2.Y.lipolytica-ScPYC1和Y.lipolytica-RoPYC2中-酮戊二酸的產(chǎn)量分別為45.2g/L和49.1g/L，比對照菌(36.3g/L)分別提高了24.5%和35.3%。丙酮酸產(chǎn)量分別為10.2g/L和6.4g/L，比對照菌(21.2g/L)分別降低了51.9%和69.8%。提高24.5%提高35.3%5M3中試結(jié)