方法驗證

吳衛(wèi)良20100820驗證一、驗證的定義驗證就是證明某一程序、生產(chǎn)過程、設(shè)備、物料、活動或系統(tǒng)確實能達(dá)到預(yù)期結(jié)果的有文件證明的一系列活動。下面就和大家一起共同討論學(xué)習(xí)。二、儀器性能的驗證

為了確保使用該儀器檢測數(shù)據(jù)真實靠，確認(rèn)該儀器的各項指標(biāo)能達(dá)到該儀器所設(shè)置的性能指標(biāo)，對該儀器進(jìn)行必要的驗證。1、輸液系統(tǒng)液相色譜儀的輸液系統(tǒng)一般由儲液罐、脫氣裝置、比例控制閥和高壓輸液泵組成；而影響分析結(jié)果的關(guān)鍵是泵的性能，對泵的性能的驗證即對泵流量準(zhǔn)確度和精密度的驗證。1.1泵流量準(zhǔn)確度的驗證

通過收集一定時間內(nèi)不同流速的流出液，然后用稱重的方法計算流出量的實際值，來判斷該泵流量的準(zhǔn)確度。

可執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)：＜±3%

下表為水流動相的測得流速設(shè)定值V1（ml/min）

1.02.02.53.03.54.05分鐘收集量（g）

收集量轉(zhuǎn)換成體積(ml)實際流速V2（ml/min）流量準(zhǔn)確度（%）（︱V2-V1︱）/V1×100%1.2泵流量精密度的驗證

通過收集一定時間內(nèi)1ml/min流速的流出液5次，然后用稱重的方法計算流出量的實際值，來判斷該泵流量的精密度。

可執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)：＜±0.3%（0.997ml/min～1.003ml/min）下表為以水流動相的測得次數(shù)123455分鐘收集量（g）收集量轉(zhuǎn)換成的體積(ml)

實際每分鐘流出量（ml/min）

流量精確度RSD（%）1.3泵梯度準(zhǔn)確度的驗證由梯度控制裝置設(shè)定特定的洗脫程序，A溶劑為水，B溶劑為0.1%丙酮的水溶液。執(zhí)行梯度程序，畫出曲線變化。根據(jù)B溶劑的含量及對應(yīng)的響應(yīng)值，來計算梯度誤差。梯度誤差一般應(yīng)小于1.0%。原理：因為流動相中丙酮的濃度和它在一定波長處的吸收成正比；所以根據(jù)比例閥來調(diào)節(jié)丙酮溶液的比例變化并記錄相應(yīng)波長下吸收線的變化，從而來確定比例閥梯度的誤差。下圖為在不斷增加B溶劑的比例的理論吸收曲線1.4壓力范圍

測試方法

在進(jìn)樣閥的出口接一個兩通，再將兩通的另外一端用OD1.6的盲管封?。粏颖?，使壓力升至所設(shè)定的壓力，觀察儀器是否自動停泵。

設(shè)定值分別為：10.0Mpa、20.0Mpa、30.0Mpa

可執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn):±0.2MPa設(shè)定值

1.5自動進(jìn)樣器（1）進(jìn)樣器影響分析結(jié)果的因素是樣品進(jìn)樣量的準(zhǔn)確度；（2）進(jìn)樣器一般有①使用微量注射器通過流通閥進(jìn)樣，樣品進(jìn)樣量取決于微量注射器的刻度和操作者；②通過流通閥和定量環(huán)進(jìn)樣，樣品進(jìn)樣量取決于定量環(huán)的容積；對定量環(huán)的容積驗證可以通過對定量管殘留量的測定進(jìn)行；用高濃度的對照品進(jìn)行進(jìn)樣，注射定量環(huán)三倍量的溶液，計算峰面積A；然后用容劑進(jìn)行進(jìn)樣，同樣注射定量環(huán)三倍量的溶液，計算峰面積B。執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)：B/A<0.02%

③通過自動進(jìn)樣裝置進(jìn)樣，樣品進(jìn)樣量取決于自動進(jìn)樣裝置的精密度和設(shè)置；對樣品進(jìn)樣量的驗證包括兩部分：一部分是某一進(jìn)樣下，連續(xù)進(jìn)樣六次，計算峰面積和保留時間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，一般不大于2%和1%；

另一部分是通過對某一樣品不同進(jìn)樣量下進(jìn)樣，計算不同進(jìn)樣量和不同峰面積的線性關(guān)系，一般應(yīng)大于0.9992UV檢測器

2.1波長準(zhǔn)確度和重復(fù)性驗證

向檢測器入口注入紫外吸收標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行波長檢測，利用其特征吸收波長與波長標(biāo)準(zhǔn)值進(jìn)行比較，計算波長示值的誤差和重復(fù)性。組號123456RSD峰面積≤2%保留時間（min）≤1%2.2噪聲與漂移

可執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)：噪聲＜±1.0×10-4AU漂移＜±5.0×10-4AU/hr測試方法：將儀器各部連接好，紫外檢測器調(diào)至250nm，流動相為甲醇，流速為1.0ml/min，待柱平衡穩(wěn)定后，進(jìn)行基線的測試，測試時間半小時，觀察并記錄測試結(jié)果。三、分析方法驗證1、準(zhǔn)確度準(zhǔn)確度系指用該方法測定值與真實值之間的一致性或接近的程度，一般用回收率（%）表示。測定方法：準(zhǔn)確度應(yīng)在規(guī)定的范圍內(nèi)建立。制備3個不同濃度的樣品，各測定3次，即測定9次，報告已知加入量的回收率（％）或測定結(jié)果平均值與真實值之差及其可信限。回收率＝（測定液平均測定值M-原樣品液含量平均值P）/加入量A×100％2、精密度精密度系指在規(guī)定的測試條件下，同一均質(zhì)樣品，經(jīng)多次取樣進(jìn)行一系列檢測所得結(jié)果之間的接近程度（離散程度）。精密度一般用偏差、標(biāo)準(zhǔn)偏差或相對標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。精密度可分為批內(nèi)精密度和批間精密度兩種。批內(nèi)精密度：是同一次測定的精密度。通常采用高、中、低三種濃度的同一樣品各7-10份，每種濃度的樣品按所擬定的分析方法操作，一次開機(jī)后，一一測定。計算每種濃度樣品的SD值或RSD值。批間精密度：是不同次測定的精密度。通常采用高、中、低三種濃度的同一樣品，每種濃度配制7-10份，置冰箱冷凍。自配制樣品之日開始，按所擬定的分析方法操作，每天取出一份測定，計算每種濃度樣品的SD值或RSD值。3、檢測限

是指分析方法能夠從背景信號中區(qū)分出被分析物時，所需樣品中藥物的最低量，可以不用準(zhǔn)確定量。LOD是一種限度檢驗效能指標(biāo)，它既反映方法與儀器的靈敏度和噪音的大小，也表明樣品經(jīng)處理后空白(本底)值的高低。要根據(jù)采用的方法來確定檢測限。當(dāng)用儀器分析方法時，可用已知濃度的樣品與空白試驗對照，記錄測得的被測藥物信號強(qiáng)度S與噪音(或背景信號)強(qiáng)度N，以能達(dá)到S／N＝2或S／N＝3時的樣品最低藥濃為LOD；也可通過多次空白試驗，求得其背景響應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)差，將三倍空白標(biāo)準(zhǔn)差(即3δ空或3S空)作為檢測限的估計值。為使計算得到的LOD值與實際測得的LOD值一致，可應(yīng)用校正系數(shù)(f)來校正，然后依之制備相應(yīng)檢測限濃度的樣品，反復(fù)測試來確定LOD。4、定量限是指在保證具有一定可靠性(一定準(zhǔn)確度和精密度)的前提下，分析方法能夠測定出的樣品中分析物的最低量。它反映了分析方法測定低藥物濃度樣品時具有的可靠性。它與上述的檢測限的差別在于：定量限要定量測定某一分析物在樣品介質(zhì)中的最低量，且定量限規(guī)定的最低量應(yīng)該符合一定的精密度和準(zhǔn)確度的要求。確定定量限的方法也因所用方法不同而異。如用儀器分析方法時，則往往將多次空白試驗測得的背景響應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)差(即空白標(biāo)準(zhǔn)差)乘以10，作為定量限的估計值，然后，再通過分析適當(dāng)數(shù)量已知接近定量限或以定量限制備的樣品來驗證。5、專屬性

專屬性系指在其他成分（如雜質(zhì)、降解產(chǎn)物、輔料等）可能存在下，采用的方法能正確測定出被測物的特性。鑒別反應(yīng)、雜質(zhì)檢查、含量測定方法均應(yīng)考察其專屬性。如方法不夠?qū)?，?yīng)采用多個方法予以補(bǔ)充。1、鑒別反應(yīng)鑒別試驗應(yīng)確證被分析物符合其特征。專屬性試驗要求證明能與可能共存的物質(zhì)或結(jié)構(gòu)相似化合物區(qū)分，需確證含被分析物的樣品呈正反應(yīng)（可與已知對照物比較），而不含被測成分的樣品呈負(fù)反應(yīng)，以及結(jié)構(gòu)相似或組分中的有關(guān)化合物，也應(yīng)呈負(fù)反應(yīng)。2、雜質(zhì)檢查在雜質(zhì)可獲得的情況下，可向供試品中加入一定量的雜質(zhì)，證明雜質(zhì)與共存物質(zhì)能得到分離和檢出，并具有適當(dāng)?shù)臏?zhǔn)確度與精密度。在雜質(zhì)或降解產(chǎn)物不能獲得的情況下，專屬性可通過與另一種已證明是合適的、分離或檢測原理不同、或具較強(qiáng)分辨能力的方法進(jìn)行結(jié)果比較來確定。必要時可采用二極管陣列檢測和質(zhì)譜檢測，進(jìn)行色譜峰純度檢查。

3、含量測定

在雜質(zhì)可獲得的情況下，對于主成分含量測定可在供試品中加入雜質(zhì)或輔料，考察測定結(jié)果是否受干擾，并與未加雜質(zhì)和輔料的試樣比較測定結(jié)果。

在雜質(zhì)或降解產(chǎn)物不能獲得的情況下，可采用另一個經(jīng)驗證了的或藥典方法進(jìn)行比較，比對兩種方法測定的結(jié)果。也可采用破壞性試驗（強(qiáng)光照射，高溫，高濕，酸、堿水解及氧化），得到含有雜質(zhì)或降解產(chǎn)物的試樣，用兩種方法進(jìn)行含量測定比較測定結(jié)果。必要時進(jìn)行色譜峰純度檢查，證明含量測定成分的色譜峰中不包含其他成分。

6、線性與范圍線性系指在設(shè)計的范圍內(nèi)，檢測結(jié)果與試樣中被分析物的濃度（量）直接呈線性比例關(guān)系的能力。范圍系指能夠達(dá)到一定的準(zhǔn)確度、精密度和線性，測試方法適用的試樣中被分析物的高低限濃度或量的區(qū)間。所謂線性范圍是指利用一種方法在取得精密度、準(zhǔn)確度均符合要求的試驗果，而且成線性的供試物濃度的變化范圍，其最大量與最小量之間的間隔。線性與范圍的確定可用作圖法(響應(yīng)值Y／濃度X)或計算回歸方程(Y＝a+bX)來研究建立。

每次作標(biāo)準(zhǔn)曲線時，方法應(yīng)與分析方法考核時完全一致。標(biāo)準(zhǔn)濃度應(yīng)包括一定梯度的5-8個濃度，每個濃度只需測定一次；標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)覆蓋樣品可能的濃度范圍，對于含量測定要求一般濃度上限為樣品最高濃度的120％，下限為樣品最低濃度的80％；目前仍廣泛采用相關(guān)系數(shù)(r)表示標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性度、并控制r≥0.9900。對照品的LOQ必須包括在線性范圍內(nèi)（LOQ測量限度）。7、耐用性(robustness)耐用性系指測定條件發(fā)生細(xì)小變動時，