第四章核酸化學4.6

核酸的分離、合成和鑒定4.1概述4.2核苷酸4.3核酸的結構4.4核酸的性質(zhì)4.5

核酸的生物學功能4.1概述1.核酸（nucleicacid）的發(fā)現(xiàn)1869年，F(xiàn).Miescher從細胞核中分離出核素。A.Kossel發(fā)現(xiàn)核素是蛋白質(zhì)和核酸的復合物，并分析出核酸的組成及各組成成分的比例。核酸核苷酸磷酸核苷戊糖堿基水解

2.核酸的組成和分類核酸分為：脫氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid，DNA）—主要集中在細胞核，線粒體和葉綠體中也有少量DNA；核糖核酸（ribonucleicacid，RNA）—90%分布在細胞質(zhì)中，10％存在于細胞核中。3.核酸的重要性

核酸是遺傳的物質(zhì)基礎1928:Griffith1928年，英國軍醫(yī)FrederickGriffith(1881~1941)以老鼠實驗發(fā)現(xiàn)，將活的良性肺炎雙球菌與死的惡性肺炎雙球菌混合，可以引起轉(zhuǎn)型，得到活的惡性菌，使老鼠死亡。

OswaldAvery(1877-1955)

MicrobiologistAveryledtheteamthatshowedthatDNAistheunitofinheritance.OneNobellaureatehascalledthediscovery"thehistoricalplatformofmodernDNAresearch",andhisworkinspiredWatsonandCricktoseekDNA'sstructure.1944年完成的肺炎球菌轉(zhuǎn)化試驗，證明DNA攜帶遺傳信息。4.2核苷酸(nucleotide)

4.2.1核苷酸的結構1.戊糖

RNA中含D-核糖(ribose)DNA中含D-2-脫氧核糖(deoxyribose)2.堿基(base)包括嘧啶堿和嘌呤堿兩類稀有堿基（minorbase）假尿嘧啶核苷次黃嘌呤核苷二氫尿嘧啶核苷甲基鳥嘌呤核苷3.核苷（nucleoside）戊糖和堿基縮合而成的糖苷稱為核苷。N9N1β1’β1’腺嘌呤核苷（adenosine，A）胞嘧啶脫氧核苷（deoxycytidine，dC）戊糖C1和嘧啶堿N1相連接戊糖C1和嘌呤堿N9相連接RNA中主要的核糖核苷DNA中主要的脫氧核糖核苷腺嘌呤核苷（adenosine，A）腺嘌呤脫氧核苷（deoxyadenosine，dA）鳥嘌呤核苷（guanosine，G）鳥嘌呤脫氧核苷（deoxyguanosine，dG）胞嘧啶核苷（cytidine，C）胞嘧啶脫氧核苷（deoxycytidine，dC）尿嘧啶核苷（uridine，U）胸腺嘧啶脫氧核苷（deoxythymidine，dT）核糖核苷和脫氧核糖核苷核苷常用單字母符號表示：如腺苷用A表示，脫氧核苷在符號前加小寫字母d，如脫氧腺苷用dA表示。稀有核苷（修飾核苷）修飾堿基與核糖或脫氧核糖連接5，6-二氫尿苷正常堿基與修飾核糖連接2`-O-甲基腺苷堿基和核糖以特殊方式連接假尿嘧啶核苷C54.核苷酸（nucleotide）核苷中戊糖的羥基磷酸酯化就形成核苷酸核糖核苷酸：2`-、3`-和5`-核苷酸脫氧核糖核苷酸：3`-和5`-脫氧核苷酸自然界存在的核苷酸為5`-核苷酸核苷酸DNARNA核苷酸核苷戊糖D-2-脫氧核糖D-核糖堿基嘌呤堿嘧啶堿腺嘌呤、鳥嘌呤胞嘧啶、胸腺嘧啶腺嘌呤、鳥嘌呤胞嘧啶、尿嘧啶酸磷酸磷酸兩類核酸的基本化學組成4.2.2核苷酸的性質(zhì)1.一般物理性質(zhì)無色粉末或結晶；易溶于水，不溶于有機溶劑；酸性溶液中不穩(wěn)定，中性和堿性溶液中很穩(wěn)定；具有旋光性

2.互變異構現(xiàn)象堿基上帶有酮基的核苷酸能轉(zhuǎn)化為烯醇式。3.紫外吸收在240~290nm有吸收，最大值在260nm附近。不同的核苷酸有不同的吸收特性。測定兩個波長的吸收值之比260/280，判斷樣品的純度。純DNA的值為1.8，純RNA的值為2.0。樣品中如有雜蛋白及苯酚，比值即明顯降低。4.核苷酸的兩性解離4.2.3核苷酸的重要衍生物1.5`-二磷酸核苷酸和5`-三磷酸核苷酸核苷三磷酸化合物在生物體內(nèi)的能量代謝中起著重要的作用。

ATP（三磷酸腺苷）在生物體內(nèi)化學能的儲存和利用中起關鍵作用；

GTP參加蛋白質(zhì)和嘌呤的合成

CTP參加磷脂的合成

UTP參加多糖的合成2.環(huán)化核苷酸

核苷酸的5`-磷酸與核糖C3`的羥基結合成環(huán)。生理功能：作為激素作用的媒介物，參與調(diào)節(jié)細胞生理生化過程，控制生物的生長、分化和細胞對激素的效應。3.輔酶類核苷酸輔酶A（CoA）3`磷酸腺苷酸泛酸氨基乙硫醇?；d體輔酶I（CoI,NAD)輔酶Ⅱ(CoII，NADP）黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）煙酰胺腺嘌呤核苷酸煙酰胺腺嘌呤二核苷酸4.3核酸的結構4.3.1DNA的結構1.DNA的堿基組成四種主要的堿基：腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶。規(guī)律：Chargaff當量規(guī)則：A=T；G=C；1949年Chargaff發(fā)現(xiàn)A與T及C與G配對現(xiàn)象。ErwinChargaff(1905-2002)

ChargaffdiscoveredthepairingrulesofDNAletters,noticingthatAmatchestoTandCtoG.具有種屬特異性；沒有組織特異性。2.DNA的一級結構

指DNA分子中核苷酸排列的順序。

核酸中核苷酸之間是通過3`，5`-磷酸二酯鍵連結。HHHp3.DNA的二級結構1951年，RosalindFranklin得到DNA分子的X-ray衍射照片，1953年，Watson與Crick解出了DNA的雙螺旋結構，此為分子生物學上的大進步。DNA雙螺旋結構的要點（1）DNA分子由兩條DNA單鏈組成。兩條鏈沿著同一根軸平行盤繞，形成右手雙螺旋結構。螺旋中的兩條鏈方向相反，即其中一條鏈的方向為5′→3′，而另一條鏈的方向為3′→5′。（2）嘌呤堿和嘧啶堿基位于螺旋的內(nèi)側，磷酸和脫氧核糖基位于螺旋外側。堿基環(huán)平面與螺旋軸垂直，糖基環(huán)平面與堿基環(huán)平面成90°角。DNA雙螺旋結構的要點（3）螺旋橫截面的直徑約為2nm，每條鏈相鄰兩個堿基平面之間的距離為3.4nm，每10個核苷酸形成一個螺旋，其螺矩（即螺旋旋轉(zhuǎn)一圈）高度為34nm。DNA雙螺旋結構的要點DNA雙螺旋結構的要點（4）兩條DNA鏈通過氫鍵相互結合形成雙螺旋。堿基的相互結合具有嚴格的配對規(guī)律，即A與T結合，G與C結合，這種配對關系，稱為堿基互補。A和T之間形成兩個氫鍵，G與C之間形成三個氫鍵。在DNA分子中，嘌呤堿基的總數(shù)與嘧啶堿基的總數(shù)相等。DNA雙螺旋的穩(wěn)定性DNA雙螺旋結構在生理條件下是很穩(wěn)定的。維持這種穩(wěn)定性的因素包括：氫鍵：兩條DNA鏈之間可形成大量的氫鍵；堿基堆積力：堿基上的芳香環(huán)具有疏水性質(zhì)，堿基的堆積使堿基之間發(fā)生締合形成了堿基堆積力，芳香族堿基的堆積，在DNA分子內(nèi)部形成了一個疏水核心，消除了介質(zhì)中水分子對堿基之間氫鍵的影響，有助于氫鍵的形成。離子鍵：是磷酸殘基上的負電荷與介質(zhì)中的陽離子（如Na+、K+和Mg2+）形成的鍵。從而降低了DNA鏈之間因負電荷而產(chǎn)生的的排斥力，增加了DNA分子的穩(wěn)定性。改變介質(zhì)條件和環(huán)境溫度，將影響雙螺旋的穩(wěn)定性。DNA雙螺旋的種類Watson-Crick的DNA雙螺旋結構是DNA鈉鹽在相對濕度為92%時的一種狀態(tài)。M.Wilkins等將DNA的二級結構分為A、B、C三種不同類型。類型結晶狀態(tài)螺距，nm每圈螺旋堿基對數(shù)堿基傾角ABC75%相對濕度，鈉鹽92%相對濕度，鈉鹽66%相對濕度，鋰鹽2.83.43.111109.320o0o6o左手螺旋DNA1979年，A.Rich等從d（GCGCGC）的X-射線衍射結果中發(fā)現(xiàn)，該片段以左手螺旋存在于晶體中，提出了左手螺旋的Z-DNA模型。

A-DNA、B-DNA及Z-DNA的比較A-DNAB-DNAZ-DNA外形每圈螺旋堿基對數(shù)螺距螺旋直徑堿基傾角右手，粗短112.82.619右手，適中103.420左手，細長124.461.89

與DNA堿基順序相關的特殊結構回文結構堿基順序顛倒重復，具有2倍對稱的DNA段落。鏡像重復顛倒重復存在與同一條鏈H-DNADNA順序具有多嘧啶-多嘌呤的特點，并具有鏡像重復。1953年初提出了DNA的三螺旋模型LinusPauling(1901-94)

Thetitanoftwentieth-centurychemistry.Paulingledthewayinworkingoutthestructureofbigbiologicalmolecules,andWatsonandCricksawhimastheirmaincompetitor.Inearly1953,workingwithoutthebenefitofX-raypictures,hepublishedapapersuggestingthatDNAwasatriplehelix.4.DNA的三級結構DNA的三級結構：雙螺旋鏈的扭曲或再次螺旋。如：超螺旋結構線狀DNA形成的超螺旋環(huán)狀DNA形成的超螺旋真核生物DNA的存在形式

真核生物DNA的三級結構是該DNA雙鏈盤繞在組蛋白上形成的負超螺旋。這種以組蛋白為核心繞以DNA片段的顆粒稱為核小體（nucleosome）。

完整的核小體由兩部分組成，即核小體核心（nucleosomecore），以及連接各核心顆粒之間的區(qū)域稱連接區(qū)（linker）。

DNA雙螺旋——核小體——串珠狀多核小體細絲——螺線管——超螺線管——染色單體1.RNA的堿基組成RNA中含有腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶四種基本堿基。堿基配對：A=U；G=C4.3.2RNA的結構

2.

RNA的一級結構

RNA分子一級結構：指各核苷酸鏈中核苷酸的排列順序。核苷酸間通過3`，5`-磷酸二酯鍵連接3.RNA的類型核糖體RNA（rRNA）信使RNA（mRNA）轉(zhuǎn)移RNA（tRNA）含量80%5%10-15%功能和蛋白質(zhì)一起組裝成核糖體，是細胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成的場所蛋白質(zhì)合成的模板在蛋白質(zhì)生物合成中起轉(zhuǎn)運氨基酸到核糖體的作用4.RNA的高級結構大多數(shù)天然RNA分子是單鏈的，多數(shù)核苷酸鏈發(fā)生自身回折，形成雙螺旋區(qū)；不能配對的堿基形成環(huán)狀突起。這種構象就是RNA的二級結構。A-U

G-C雙螺旋區(qū)tRNA的三葉草形二級結構特征：tRNA分子一般由四臂四環(huán)組成；氨基酸臂反密碼臂二氫尿嘧啶臂TψC臂反密碼環(huán)二氫尿嘧啶環(huán)（DHU環(huán)）TψC環(huán)可變環(huán)（額外環(huán)）反密碼子7對5對4對5對tRNA的三級結構在三葉草型二級結構的基礎上，突環(huán)上未配對的堿基由于整個分子的扭曲而配成對，目前已知的tRNA的三級結構均為倒L型TψC環(huán)DHU環(huán)反密碼環(huán)mRNA的結構5'3'm7GpppAAA……An編碼區(qū)AUGUAA多聚腺苷酸(polyA)帽子結構7-甲基鳥嘌呤核苷三磷酸真核細胞mRNA的3’-末端有一段長達200個核苷酸左右的聚腺苷酸(polyA)，稱為“尾結構”，5’-末端有一個甲基化的鳥苷酸，稱“帽結構”。真核生物mRNA與原核生物的不同之處

真核生物mRNA的特殊結構：5’-末端的帽結構：m7G-ppp5’-Nmp促進核糖體與mRNA的結合加速翻譯的起始速度增強mRNA的穩(wěn)定性3’-末端的polyA結構:參與mRNA從核內(nèi)向胞質(zhì)的轉(zhuǎn)移增強mRNA的穩(wěn)定性真核生物mRNA含有內(nèi)含子:在核內(nèi)需經(jīng)過一系列的加工、修飾及剪接等去除內(nèi)含子，轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒斓膍RNA，進入胞漿。rRNA的二級結構原核生物核糖體中有三類rRNA：5SrRNA、16SrRNA和23SrRNA；真核生物核糖體中有四類rRNA：5SrRNA、5.8SrRNA、18SrRNA和28SrRNA；大腸桿菌16SrRNA大腸桿菌5SrRNA真核生物18SrRNA4.3.3核酸中核苷酸順序的測定1.核酸酶（nucleases）能水解核酸的酶稱為核酸酶。催化在水參與下磷酸二酯鍵的切斷。a—產(chǎn)生5`磷酸末端b—產(chǎn)生3`磷酸末端核酸酶底物作用點外切核酸酶蛇毒磷酸二酯酶牛脾磷酸二酯酶RNA、DNARNA、DNAab內(nèi)切核酸酶RNaseA枯草桿菌RnaseRnaseT1RnaseT2DnaseIDnaseIIRNA-PyRNARNA-GRNADNADNAbbbbab脫氧核糖核酸酶（DNase）

核糖核酸酶（Rnase）

非特異性核酸酶限制性內(nèi)切酶（restrictionendonuclease）對DNA具有較高的堿基專一性，能使別DNA分子中特定的堿基順序，并在特定的位置切割。產(chǎn)生粘性末端產(chǎn)生平整末端4.4核酸的性質(zhì)1.性狀和溶解度DNA為白色纖維狀固體；RNA為白色粉末；微溶于水；不溶于有機溶劑；鈉鹽易溶于水2.粘度DNA溶液粘度極大；RNA比DNA粘度小。3.分子大小相對分子量都很大，DNA相對分子量的比RNA的大。

可用紫外分光光度計測定樣品是否純品：純DNA:A260/A280=1.8純RNA:A260/A280=2.0核酸含量1A相當于50ug/ml雙螺旋DNA或40ug/ml單螺旋DNA（或RNA）或20ug/ml寡核苷酸。4.

吸收光譜核酸在240~290nm有紫外吸收，一般在260nm左右有最大吸收。摩爾磷吸收系數(shù)E（P）：以每升核酸溶液中1mol磷為標準，計算核酸的吸收系數(shù)。

W－每升溶液中磷的重量（g）

DNA：E（p）=6000~8000RNA：E（p）=7000~10000

5.變性、復性和雜交核酸的變性（denaturation）引起核酸變性的因素溫度升高；酸、堿、射線；尿素等變性劑。變性后現(xiàn)象260nm紫外吸收值升高（增色效應）；粘度降低；沉降速度增加；失去部分或全部生物活性。

DNA的變性溫度：加熱DNA溶液，使其對260nm紫外光的吸收度突然增加，達到其最大值一半時的溫度為DNA的變性溫度（熔解溫度，熔點Tm）。DNA的Tm值大小與下列因素有關G-C含量（G+C）%=（Tm-69.3）×2.44DNA的均一性均一性高，Tm較低。介質(zhì)中的離子強度離子強度較低的介質(zhì)中，DNA的Tm較低。大腸桿菌DNA在不同濃度KCl中的熔解復性（renaturation）變性DNA在適當?shù)臈l件下，兩條彼此分開的單鏈可以重新締合成為雙螺旋結構，這一過程稱為復性。DNA的復性主要受以下因素影響：DNA的復雜程度：越簡單越容易復性；DNA濃度的大?。涸礁咴揭讖托?；DNA片段的大小：越小越易復性；溫度：比Tm低25oC左右最易復性，如超過Tm再迅速冷卻不能復性，熱變性DNA緩慢冷卻時才可復性。雜交（hybridization）兩種來源不同具有互補堿基序列的多核苷酸片斷在溶液中冷卻時可以再形成雙螺旋結構。雜交DNA分子DNA/RNA雜交分子6、沉降密度：RNA>雙鏈DNA；環(huán)狀DNA>開環(huán)、線狀DNA單鏈DNA>雙鏈DNA沉降速度：RNA>環(huán)狀DNA>開環(huán)、線狀DNA

4.5核酸的生物學功能4.5.1DNA是生物遺傳的主要物質(zhì)基礎。DNA的復制方式—半保留復制4.5.2RNA與生物遺傳信息的表達首先，DNA通過轉(zhuǎn)錄作用，將其所攜帶的遺傳信息（基因）傳遞給mRNA,在mRNA、tRNA和rRNA的共同作用下，完成蛋白質(zhì)的合成。中心法則生物的遺傳信息從DNA傳遞給mRNA的過程稱為轉(zhuǎn)錄。根據(jù)mRNA鏈上的遺傳信息合成蛋白質(zhì)的過程，被稱為翻譯和表達。1958年Crick將生物遺傳信息的這種傳遞方式稱為中心法則。mRNA是DNA的轉(zhuǎn)錄本，攜帶有合成蛋白質(zhì)的全部信息。蛋白質(zhì)的生物合成實際上是以mRNA作為模板進行的。遺傳密碼

4.5.3蛋白質(zhì)的生物合成4.5.4遺傳變異的化學本質(zhì)DNA結構的改變將導致相應蛋白質(zhì)一級結構（氨基酸順序）的變化，從而引起生物特征或性狀發(fā)生變異。所以，一切生物的變異和進化都可以認為是由于DNA結構的改變而引起蛋白質(zhì)組成和性質(zhì)變化的結果。DNA結構變化的類型及影響因素DNA遺傳密碼的改變主要有如下幾種類型：堿基順序顛倒，如TA被顛倒成AT；某個堿基被調(diào)換，如AT換成GC；③少了或多了一對或幾對堿基，例如：5’ATGGCTATGC3’變成5’ATGGTATGC3’3’TACCGATACG5’3’TACCATACG5’基因突變由于DNA堿基順序的改變引起生物遺傳性狀顯著變化的現(xiàn)象，稱為基因“突變”。(1)DNA分子中堿基互變異構DNA分子的堿基，存在酮式—烯醇式或氨式—亞胺式互變異構。不同的互變異構體形成氫鍵的方向和能力不同，有可能導致復制時出現(xiàn)錯誤。例如在正常情況下，A（氨式結構）與T（酮式結構）配對；當A以亞胺式存在時（幾率非常?。?，則與C配對。(2)物理因素能夠引起基因突變的物理因素主要包括：紫外線（UV）、高能射線和電離輻射等。當DNA受到大劑量紫外線（波長260nm附近）照射時，可引起DNA鏈上相鄰的兩個嘧啶堿基共價聚合，形成二聚體，例如TT二聚體。光聚合反應

胸腺嘧啶堿基在紫外光照射下，可以發(fā)生二聚加成反應：

在DNA分子中，如果兩個胸腺嘧啶堿基相鄰，在紫外光照射下，可能發(fā)生上述聚合反應，其結果是破壞了正常復制或轉(zhuǎn)錄。(3)化學因素化學因素是引起DNA結構發(fā)生變化的最常見因素，主要包括：烷基化試劑亞硝酸鹽堿基類似物烷基化反應由于含氧堿基存在酮式和烯醇式的互變異構，烯醇式中的羥基可以被烷基化轉(zhuǎn)變?yōu)榉€(wěn)定的烯醇醚。鳥嘌呤核苷烷基化形成6-甲氧基鳥嘌呤核苷后，不再與C配對，而與T配對。這種情況將引起DNA的復制、轉(zhuǎn)錄及信息表達出現(xiàn)錯誤。環(huán)外氨基的反應

胞嘧啶核苷在亞硝酸作用下，可以形成重氮鹽，再轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏ず塑?。因此生物體內(nèi)亞硝酸的存在有可能改變DNA的堿基組成。腺嘌呤核苷和鳥嘌呤核苷也能發(fā)生類似的反應，分別形成次黃嘌呤核苷（I）和黃嘌呤核苷（X）。堿基類似物是一類結構與核酸堿基相似的人工合成或天然化合物，由于它們的結構與核酸的堿基相似，當這些物質(zhì)進入細胞后能夠摻入到DNA鏈中，干擾DNA的正常復制和轉(zhuǎn)錄。4.6核酸的分離、合成和鑒定原理4.6.1核酸的分離和純化提取分離核酸的一般原則：破碎細胞，提取核蛋白使其與其他細胞成分分離；用蛋白質(zhì)變性劑或蛋白酶處理除去蛋白質(zhì)；獲得的核酸溶液用乙醇等使其沉淀。4.6.2合成酶促合成法化學合成法4.6.3鑒定和含量測定含量測定1、定磷法RNA平均含磷量：9.0%DNA平均含磷量：9.2%2、定糖法核糖的測定脫氧核糖的測定3、紫外吸收法提要核酸分為兩大類：DNA和RNA，所有生物都含有這兩類核酸。核酸是線形多聚核苷酸，其基本結構單位是核苷酸；核苷酸又是由堿基、戊糖及磷酸組成?？臻g結構Watson-