ICS65.020CCSB16

DB51四 川 省 地 方 標(biāo) 準(zhǔn)DB51/T2964—2022口岸松材線蟲疫情監(jiān)測(cè)技術(shù)規(guī)范Technicalstandardformonitoringthepinewoodnematodeatports20222022122720230201四川省市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布目 次前言 II1范圍 12規(guī)性用件 13術(shù)和義 14監(jiān)范圍 35應(yīng)監(jiān)的物其品 36制監(jiān)計(jì)及施案 37監(jiān)方法 38實(shí)室測(cè) 49監(jiān)樣的存處理 610測(cè)果理 6附A（料附）材蟲關(guān)7附C（料附）材蟲介及特征 11附附C（料附）材蟲介及特征 11附D（料附）材蟲其似種 17附E（范附）異PCR定法 26附F（范附）時(shí)光PCR定法 28附G（范附）DNA形碼 30參考獻(xiàn) 32前 言本文件按照GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。麗華、宿白玉、劉國(guó)瑛、張軍、劉俊。本文件為首次發(fā)布。口岸松材線蟲疫情監(jiān)測(cè)技術(shù)規(guī)范范圍（GB/T23476-2009松材線蟲病檢疫技術(shù)規(guī)程GB/T23478松材線蟲普查監(jiān)測(cè)技術(shù)規(guī)程SN/T1132-2002松材線蟲檢疫鑒定方法SN/T2757植物線蟲檢測(cè)規(guī)范SN/T4350-2015旅客攜帶物和郵寄物檢疫鑒定和處理程序3術(shù)語和定義SN/T2757植物線蟲檢測(cè)規(guī)范SN/T4350-2015旅客攜帶物和郵寄物檢疫鑒定和處理程序3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1口岸port是國(guó)家批準(zhǔn)對(duì)外開放，允許人員、貨物、交通工具、寄遞物等進(jìn)出國(guó)境的地方。3.2松材線蟲pinewoodnematode學(xué)名：Bursaphelenchusxylophilus(Steiner&Buhrer)Nickle,1970habddaTenchnapheenhodeapheenhoddae寄生滑刃亞科（Parasitaphelenchinae），傘滑刃屬（Bursaphelenchus），能引起松樹萎蔫病，是針葉樹A。3.3媒介昆蟲intermediaryinsect能攜帶松材線蟲并能將松材線蟲傳遞給寄主樹木的天牛。在自然條件下，松材線蟲需依靠墨天牛屬（Monochamus）的天牛實(shí)現(xiàn)近距離傳播。3.4松褐天牛MonochamusalternatusHope,1843又名松墨天牛、松天牛，屬于天?？疲–erambycidae）、墨天牛屬（Monochamus），是為害松樹的一種蛀干性昆蟲，為傳播松材線蟲的主要媒介天牛。3.5云杉花墨天牛MonochamussaltuariusGebler,1830又名云杉花黑天牛，屬于天?？疲–erambycidae）、墨天牛屬（Monochamus），是一種蛀干性昆蟲，是松材線蟲病的傳播媒介昆蟲。3.6木材wood帶皮或不帶皮的原木、鋸木、木板、木片等。3.7原木rawwoods未經(jīng)過干燥、化學(xué)防腐劑等處理，并未永久改變其特性的木材。3.8松木及其制品pinewoodandwoodenware指松科木材和由松科木材為原料制作的產(chǎn)品，包括松木木質(zhì)包裝材料。經(jīng)人工合成或經(jīng)加熱、加壓等深度加工的木質(zhì)材料（如膠合板、纖維板等）除外。3.9木質(zhì)包裝材料woodpackingmaterials用于承載、包裝、鋪墊、支撐、加固貨物的木質(zhì)材料，如木板箱、木條箱、木托盤、木框、木桶、木軸、木楔、墊木、枕木、襯木等。3.10疫木diseasedwood感染松材線蟲病的寄主植物及其制品，主要為松屬植物及其制品。3.11藍(lán)變blue-stain3.12海關(guān)指定監(jiān)管場(chǎng)地customsdesignatedsupervisionsite場(chǎng)地3.13海關(guān)監(jiān)管貨物cargoundercustomssupervision3.14誘捕器監(jiān)測(cè)trapmonitoring利用人工合成引誘劑來捕獲松墨天牛，并檢查其體內(nèi)、體表是否攜帶松材線蟲的一種監(jiān)測(cè)方法。3.15松墨天牛引誘劑pinesawyerattractant對(duì)松墨天牛成蟲具有引誘活性的揮發(fā)性化合物，如萜烯類等特異性植物源物質(zhì)、昆蟲源信息素等，需與松墨天牛誘捕器配合使用。（場(chǎng)地A.6SN/T1724-2006中6.26.3SN/T4350-201556B.1m～100mGB/T23478誘捕時(shí)間一般為每年的4月下旬至10月底（不同地區(qū)有差異），即松墨天牛成蟲羽化初期開始，直至當(dāng)年成蟲羽化完畢為宜?？筛鶕?jù)監(jiān)測(cè)需要選用商品化的高效引誘劑。1d～5d1.5m～2.010d～15d1誘捕器每隔3d～5d檢查一次，及時(shí)收集并清理誘捕器中的媒介天牛，并在當(dāng)日送實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。詳細(xì)記錄相關(guān)信息，填寫附錄表B.2。23476-2009C20℃～30h～24h0c（10m（10X～20X，2h鏡檢100μL～200（1050μL左右為宜。在酒精燈上以1s左右的頻率通過8次10202014011100/（a）、體長(zhǎng)/（c）/（c’）20SN/T2757按照SN/T1132-2002中附錄C.2相關(guān)內(nèi)容執(zhí)行。按照SN/T1724-2006中附錄B執(zhí)行?；騊CRPCR或DNAPCRPCRDNASN/T1132-2002中第D松材線蟲特異PCR檢測(cè)見附錄E，實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)見附錄F，DNA條形碼鑒定見附錄G。8.5.2分子生物學(xué)檢測(cè)依據(jù)附錄E～附錄G相關(guān)內(nèi)容進(jìn)行判定，檢測(cè)結(jié)果呈陽性的可鑒定為松材線蟲。復(fù)核CNAS4（應(yīng)（）（（56℃30min）3附錄A（）松材線蟲最早于1929年從美國(guó)德克薩斯州的長(zhǎng)葉松（Pinuspalustris）木材中分離到，被描述為AphelenchoidesxylophilusSteiner&190519711972Bursaphelenchuslignicolus1981Bursaphelenchusxylophilus（Steiner&Buhrer，1934）Nickle，1970。（20我國(guó)1982202067341871375.30112.481998年，葡萄牙海岸松發(fā)現(xiàn)松材線蟲，這是歐盟境內(nèi)首次報(bào)道該病。2009年，西班牙發(fā)現(xiàn)松材線蟲。美國(guó)、加拿大、墨西哥、日本、韓國(guó)、西班牙、葡萄牙、中國(guó)。松材線蟲通過墨天牛屬（Monochamus）4d～5（M.alternatus）（M.saltuarius），（M.carolinensis），（M.galloprovincialis）122（J3與4（J1至J4），在4J3J4齡幼蟲JIV（）J4。寄主（Pinusspp.）（P.massoniana）、黑（P.（P.（Abies（Picea（P.canadensis）（P.pungens）（Larixeuropaea）（L.（Cedrus（C.松屬以外的寄主很少在感染松材線蟲后死亡。目前僅美國(guó)報(bào)道藍(lán)杉（Piceapungens）（Pseudotsugamenziesii）感染松材線蟲后死亡。2μm。1μm的占77%（其中圓尾型占44%），超過1μm（1.46μm～3.41μm）的占23%。2005年，趙文霞等報(bào)道，4.2151.7μm，最長(zhǎng)達(dá)2.9μm。但該線蟲經(jīng)灰葡萄孢培養(yǎng)后，所有雌蟲尾均寬圓，無尾2009μm～1.2μm，較本文的群體更短。2011年，顧建鋒等報(bào)道了一種美國(guó)木質(zhì)包裝中截獲的松材μm～1μm1μm～2μm10%的雌蟲尾尖突為μm～2.4μm，其余雌蟲則無尾尖突或小于0.5μm。2020年，顧建鋒等從遼寧紅松分離2～31.8μm(0.3μm～3.2μm由此可見，無論是國(guó)內(nèi)外松材線蟲群體，都有不少關(guān)于雌蟲尾尖突變異的報(bào)道。2μm的情況是比較罕見的，從實(shí)驗(yàn)室對(duì)上千批次松材12μm附錄B（規(guī)范性附錄）口岸松材線蟲疫情監(jiān)測(cè)記錄表表B.1～B.2給出了口岸松材線蟲疫情監(jiān)測(cè)情況記錄表。表B.1口岸松材線蟲疫情監(jiān)測(cè)抽樣記錄表時(shí)間口岸樣品編號(hào)樣品來源報(bào)關(guān)單號(hào)或郵件號(hào)來源渠道樣品類型抽樣場(chǎng)所外部癥狀取樣部位有無天牛危害有無藍(lán)變是否發(fā)現(xiàn)活蟲及采取的措施取樣數(shù)量備注【口岸】填寫抽樣所在地口岸具體名稱；【樣品編號(hào)】填寫“關(guān)區(qū)代碼+日期+2位流水號(hào)”，確保唯一性和可溯源性；【樣品來源】填寫樣品來自哪個(gè)國(guó)家或地區(qū)；【來源渠道】填寫貿(mào)易渠道、非貿(mào)易渠道；【口岸】填寫抽樣所在地口岸具體名稱；【樣品編號(hào)】填寫“關(guān)區(qū)代碼+日期+2位流水號(hào)”，確保唯一性和可溯源性；【樣品來源】填寫樣品來自哪個(gè)國(guó)家或地區(qū)；【來源渠道】填寫貿(mào)易渠道、非貿(mào)易渠道；【樣品類型】填寫貨物、木質(zhì)包裝、旅客攜帶物、郵遞物等；【抽樣場(chǎng)所】填寫查驗(yàn)場(chǎng)所、快件中心、監(jiān)管作業(yè)場(chǎng)所、貨物堆放場(chǎng)所、檢疫處理場(chǎng)所等；【外部癥狀】依據(jù)抽樣對(duì)象具體描述；【取樣部位】依據(jù)抽樣對(duì)象具體描述；【有無天牛危害】填寫是或否；【有無藍(lán)變】填寫是或否；【備注】對(duì)上述內(nèi)容信息進(jìn)行必要補(bǔ)充。表B.2口岸松材線蟲誘捕監(jiān)測(cè)記錄表口岸：注：【誘捕器編號(hào)】填寫“關(guān)區(qū)代碼+場(chǎng)所代碼+2位流水號(hào)”，確保唯一性和可溯源性；【檢查時(shí)間】具體到年月日；【監(jiān)測(cè)地點(diǎn)】填寫具體地點(diǎn)信息,如貨物堆放場(chǎng)所、檢疫處理場(chǎng)所或周邊區(qū)域等；【地理坐標(biāo)】填寫具體經(jīng)緯度。誘捕器編號(hào)檢查時(shí)間監(jiān)測(cè)地點(diǎn)地理坐標(biāo)捕獲天牛數(shù)量誘劑添加/更換情況監(jiān)測(cè)點(diǎn)是否變更檢查人附錄C（資料性附錄）松材線蟲組介紹及鑒定特征15——松材線蟲B.xylophilus（Steiner&Buhrer，1934）Nickle，1970——偽傘滑刃線蟲B.fraudulentusRühm，1956（J.B.Goodey，1960）——擬松材線蟲B.mucronatusMamiya&Enda，1979——錐尾傘滑刃線蟲B.conicaudatusKanzaki，Tsuda&Futai，2000——鮑嘉傘滑刃線蟲B.baujardiWaliaNegi，Bajaj&Kalia，2003——灰黃錦天牛傘滑刃線蟲B.luxuriosaeKanzaki&Futai，2003——豆傘滑刃線蟲B.douiBraasch，Gu，Burgermeister&Zhang，2004——新加坡傘滑刃線蟲B.singaporensisGu，Zhang，Braasch&Burgermeister，2005——大尖尾傘滑刃線蟲B.macromucronatusGu，Zheng，Braasch&Burgermeister，2008——楊傘滑刃線蟲B.populiTomalak&Filipiak，2010——擬灰黃錦天牛傘滑刃線蟲B.paraluxuriosaeGu,Wang,Braasch,2012——日本冷杉傘滑刃線蟲B.firmaeKanzaki,Maehara,Aikawa&Matsumato,2012——韓國(guó)傘滑刃線蟲B.koreanusGu,Wang&Chen,2013——吉拉尼傘滑刃線蟲B.gillaniiSch?nfeld,Braasch,Riedel&Gu,2013——錦天牛屬傘滑刃線蟲B.acaloleptaeKanzaki,Ekino,Maehara,Aikawa&Giblin-Davis,2019（）；個(gè)，P4明顯，P3和P4（圖C.1）（表C.1，表C.2）。注：A.側(cè)線和雄蟲尾乳突排列；B.雄蟲尾乳突排列；C.交合刺形態(tài)；D.雌蟲陰門蓋；P1～P4.尾乳突。圖C.1典型的松材線蟲組線蟲的特征表C.1松材線蟲組雄蟲交合刺和雌蟲尾形特征圖種類交合刺雌蟲尾松材線蟲（圓尾型）偽傘滑刃線蟲擬松材線蟲（歐洲亞種）擬松材線蟲（東亞亞種）錐尾傘滑刃線蟲鮑嘉傘滑刃線蟲灰黃錦天牛傘滑刃線蟲擬灰黃錦天牛傘滑刃線蟲種類交合刺雌蟲尾豆傘滑刃線蟲新加坡傘滑刃線蟲大尖尾傘滑刃線蟲楊傘滑刃線蟲日本冷杉傘滑刃線蟲韓國(guó)傘滑刃線蟲吉拉尼傘滑刃線蟲錦天牛屬傘滑刃線蟲表C.2松材線蟲組雌蟲尾形顯微特征圖種類雌蟲尾1雌蟲尾2松材線蟲（圓尾型R型）偽傘滑刃線蟲擬松材線蟲歐洲亞種擬松材線蟲東亞亞種錐尾傘滑刃線蟲擬灰黃錦天牛傘滑刃線蟲豆傘滑刃線蟲新加坡傘滑刃線蟲種類雌蟲尾1雌蟲尾2大尖尾傘滑刃線蟲楊傘滑刃線蟲韓國(guó)傘滑刃線蟲吉拉尼傘滑刃線蟲錦天牛屬傘滑刃線蟲附錄D（資料性附錄）松材線蟲及其近似種顯微特征圖D.1～圖D.9給出了松材線蟲及其近似種的顯微特征照片。注：A.頭部；B.陰門區(qū)（有陰門蓋）；C～F.雄蟲尾部及交合刺；G～K.雌蟲尾部（通常尾端鈍圓，無尾尖突；有時(shí)一些個(gè)體有尾尖突，但不超過2μm）。圖D.1典型的松材線蟲雌雄蟲照片(標(biāo)尺=10μm)注：A.持久型幼蟲；B.繁殖型幼蟲；C.雌蟲；D.雄蟲；E.繁殖型幼蟲體前端；F.雌蟲陰門區(qū)；G.繁殖型幼蟲尾部；H.雌蟲尾部；I.雄蟲尾部。圖D.2不同發(fā)育階段松材線蟲形態(tài)圖(標(biāo)尺=10μm)注：A.頭部；B.生殖原基；C-I.尾部。圖D.3松材線蟲持久型幼蟲頭部和尾部顯微特征圖(標(biāo)尺=10μm)注：23%，其余絕大部分均有或長(zhǎng)或短的尾尖突，末端鈍圓或銳尖，長(zhǎng)1.8μm±0.7μm0.3μm～3.2μm)。但經(jīng)灰葡萄孢人工培養(yǎng)后，所有的雌蟲尾端鈍圓，均無尾尖突。A～N.直接從紅松樣品分離到的松材線蟲雌蟲尾形；O.圖D.4遼寧紅松中分離到的松材線蟲雌蟲尾尖形態(tài)圖(標(biāo)尺=10μm)注：A.體前部；B.中食道球區(qū)；C、E.雄蟲尾部；D.雌蟲陰門區(qū)；F～I(xiàn).雌蟲尾部。松材線蟲M型株系雌蟲具有長(zhǎng)約2.2μm～3.0μm的尾尖突，且經(jīng)人工培養(yǎng)后仍如此。而松材線蟲R型株系盡管有些個(gè)體會(huì)有短尾尖突，甚至有些群體大部分都有尾尖突，但尾尖突一般在人工培養(yǎng)后消失。目前M型松材線蟲僅分布于北美，其寄主主要是冷杉屬，因此，口岸檢疫時(shí)發(fā)現(xiàn)M型松材線蟲的頻次極低，必要時(shí)需通過分子生物學(xué)方法核實(shí)。圖D.5松材線蟲M型株系(標(biāo)尺=10μm)圖D.6擬松材線蟲東亞亞種（上面4幅）和歐洲亞種（下面4幅）雌蟲尾形圖(標(biāo)尺10μm)注：A.頭部；B.交合傘及尾乳突；C-D、F-G、J-K.雌蟲尾部；E、I.雄蟲尾部及交合刺；H.陰門及陰門蓋。圖D.7偽傘滑刃線蟲（B.fraudulentus）(標(biāo)尺=10μm)IJ注：IJ注：A-B.陰門；C.交合刺；D.交合傘；E-H.培養(yǎng)后雌蟲尾部；I-L.原木中分離到的雌蟲尾部圖D.8豆傘滑刃線蟲新種雄蟲顯微照片(標(biāo)尺=10μm)ABCABCDEFGHKLEFGHKL注：A、B.頭部；C.雌蟲陰門蓋；D.雌蟲陰門至尾末端；E-F.培養(yǎng)后的雌蟲尾部形態(tài)；G.木質(zhì)包裝中直接分離的雌蟲尾部；H.雄蟲交合傘；I,J.雄蟲交合刺。圖D.9楊傘滑刃線蟲光學(xué)顯微照片(標(biāo)尺=10μm)附錄E（）PCR試劑10PRBuer（g2+、aqMseMdH。DNA方法方法將1ddH2O200μLPCR含8μLddH2O1μL10×PCRBuffer（Mg2+free））1（），85℃加熱2minPCR1μL1mg/mL蛋白酶K，56℃15min，95℃加熱10minDNADNAPCR或者于-20℃）。特異PCR引物序列見表E.1。表E.1引物序列E.2.2.2特異PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系及參數(shù)PCRE.2X-F/X-R℃4℃30℃特異PCR引物序列見表E.1。表E.1引物序列E.2.2.2特異PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系及參數(shù)PCRE.2X-F/X-R℃4℃30℃30℃1min，35725J10-1和J10-2Rc945min；9430sec，641min，72℃1min，35725。引物名稱堿基序列擴(kuò)增片段長(zhǎng)度X-F5’-ACGATGATGCGATTGGTG-3’約560bpX-R5’-TATTGGTCGCGGAACAAACC-3’J10-15’-GGTGTCTAGTATAATATCAGAG-3’約160bpJ10-2Rc5’-GTGAATTAGTGACGACGGAGTG-3’表E.2PCR試劑名稱加樣量μL2×TaqMasterMix預(yù)混液25正向引物（濃度10μmol/L）2反向引物（濃度10μmol/L）2DNA模板2ddH2O補(bǔ)足反應(yīng)總體積至50μL以松材線蟲DNA模板作為陽性對(duì)照，以不含松材線蟲的DNA模板作為陰性對(duì)照，以ddH2O作為空白對(duì)照。配制GelRed（0.55μLPCR100bpDNAMarker3V/cm～5V/cm0.5h在陽性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照正確的前提下，經(jīng)瓊脂糖電泳：采用X-F/X-R引物對(duì)擴(kuò)增后，電泳檢測(cè)得到與陽性對(duì)照一致的560bp左右大小的特有條帶，或采用J10-1/J10-2Rc引物對(duì)得到160bp左右大小的特有條帶，判定結(jié)果為陽性；否則判定結(jié)果為陰性。陽性對(duì)照、陰性對(duì)照和（或）空白對(duì)照不正確，無論待測(cè)樣品結(jié)果如何，應(yīng)重復(fù)試驗(yàn)。附錄F（）PCR試劑10×PCRBuffer（Mg2+free）、蛋白酶K、2×TaqMasterMix預(yù)混液、ddH2O。DNA操作方法見附錄E.2.1PCR引物及探針序列見表F.1。F.2.2.2實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系及參數(shù)3F.2.2.2實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系及參數(shù)33DNADNADNADNAPCRF.2表F.2實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系實(shí)時(shí)熒光PCR的反應(yīng)參數(shù)：95℃10min；95℃15sec，60℃45sec，共40個(gè)循環(huán)。對(duì)PCR反應(yīng)管熒光信號(hào)的收集條件應(yīng)與探針的熒光基團(tuán)一致，具體設(shè)置方法參照相應(yīng)熒光PCR儀的使用說明。F.2.3結(jié)果判定引物名稱堿基序列正向引物BsatF5’-TGACGGAGTGAATTGACAAGACA-3’反向引物BSatRV5’-AAGCTGAAACTTGCCATGCTAAA-3’探針BSatS5’-FAM-ACACCATTCGAAAGCTAATCGCCTGAGA-TAMRA-3’注：探針5’端含有FAM基團(tuán)的熒光染料，3’端含有TAMRA基團(tuán)的熒光染料。試劑名稱加樣量μL2×TaqMasterMix預(yù)混液25引物BsatF（濃度10μmol/L）2引物BSatRV（濃度10μmol/L）2探針BSatS（10μmol/L）1DNA模板2ddH2O補(bǔ)足反應(yīng)總體積至50μLPCR5～15值=40在陽性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照正確的前提下：——如果待測(cè)樣品的Ct值等于40時(shí)，則判定結(jié)果為陰性；——如果待測(cè)樣品的Ct值小于或等于35時(shí)，則判定結(jié)果為陽性；Ct4035Ct40Ct35Ct4035附錄G（DNA試劑10×PCRBuffer（Mg2+free)、蛋白酶K、2×TaqMasterMix預(yù)混液、ddH2O。DNA操作方法見E.2.128S引物序列見表G.1。表G.1引物序列引物名稱堿基序列擴(kuò)增片段D2A5′-ACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTG-3′約800bpD3B5′-TCGGAAGGAACCAGCTACTA-3′G.2.2.2G.2.2.2PCRPCR反應(yīng)體系參見附錄表E.2。反應(yīng)參數(shù)94℃4min；94℃30sec，55℃30sec，72℃1min，37個(gè)循環(huán)；72℃8min。操作方法見附錄E.2.3。該引物正常的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小為800bp左右，若樣品PCR擴(kuò)增獲得正常產(chǎn)物，可送擴(kuò)增產(chǎn)物到生物測(cè)序公司雙向測(cè)序（可要求公司進(jìn)行拼接），建議每個(gè)樣品做3個(gè)以上重復(fù)。G.3DNAG.3.1序列拼接使用Chormas軟件或其他序列分析軟件，對(duì)28S基因測(cè)序得到的雙向峰圖文件（后綴名.ab）進(jìn)行拼接。為確保DNA條形碼序列的可靠性，需對(duì)測(cè)序質(zhì)量進(jìn)行評(píng)估，去除測(cè)序結(jié)果兩端峰形雜亂的低質(zhì)量序列，并去除引物所在序列區(qū)域，獲得相應(yīng)的DNA序列。拼接完成后，DNA序列方向應(yīng)與PCR擴(kuò)增正向引物方向一致并保證序列長(zhǎng)度大于740bp。G.3.2序列比對(duì)登陸NCBI網(wǎng)站中的BLAST（basic local alignment search tool）頁(yè)面（/Blast.cgi）進(jìn)行比對(duì)。在BasicBLAST中選擇nucleotideblast，在EnterQuerySequence（Per.Ident）。在BLAST結(jié)果中查看序列相似性最高的物種，一般為與查詢序列最接近的物種。G.4結(jié)果判定若待測(cè)樣品序列與已知的松材線蟲序列（AY508107.1、EF446929.1-EF446933.1、EF446935.1、FJ768948.1EU295491.1、DQ364687.1、DQ356002.1、EU295503.1、AY508108.1、AY508105.1、MN270176.1、MW012949.1、AM396580.1等）相似性（Per.Ident值）達(dá)98.98%以上，與其他種類的相似性小于98.73%，可判定為松材線蟲陽性。若待測(cè)樣品序列與已知的松材線蟲相似性低于98.98%，則可能不是松材線蟲。如BLAST結(jié)果所顯示的線蟲不是傘滑刃屬線蟲，甚至不是線蟲，很可能是實(shí)驗(yàn)過程中由于操作不當(dāng)引入的其他微生物污染和樣品交叉污染，須重復(fù)實(shí)驗(yàn)過程。參考文獻(xiàn),[M].,2011.劉偉.[J].,1995,10(2):223-225.夏永剛,王明旭,張玉榮,等.[J].湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2009.,[J].,2005,18(3):362-363.鄭煒,,等[J].,2007(03):38-40.BraaschH,BurgermeisterW,GuJ.RevisedintragenericgroupingofBursaphelenchusFuchs,1937(Nematoda:Aphelench