組織化學技術(shù)教程

（內(nèi)部教材，僅供參考）組織化學技術(shù)教程（內(nèi)部教材，僅供參考）1序言

現(xiàn)代組織化學是介入細胞生物學、組織形態(tài)學、化學與生物化學及分子生物學之間的一門新興邊緣學科，它已滲透和應用于生命科學的許多學科。近幾十年來，組織化學的發(fā)展，突飛猛進，日新月異，已產(chǎn)生了許多分支，而各類分支雖有特點，但都源于組織化學。因此，組織化學已成為醫(yī)學生物學科研過程中必備知識之一。序言現(xiàn)代組織化學是介入細胞生物學、2

為使廣大生物醫(yī)學青年教師、研究生、醫(yī)學高等職業(yè)技術(shù)學校?？粕坝嘘P(guān)實驗技術(shù)人員盡快掌握組織化學基本技術(shù)，作者借鑒其他兄弟院校之經(jīng)驗，編寫了簡明的組織化學技術(shù)教程。由于時間倉促，有些知識未編入其中，有待完善。書中疏漏，不妥之處，望廣大讀者批評指正。

穆長征

2003年10月為使廣大生物醫(yī)學青年教師、研究生、醫(yī)學3第一章

緒論

組織化學（histochemistry）是運用物理學、化學、免疫學、分子生物學等原理與技術(shù)，對組織與細胞的化學成分、化學反應及其變化規(guī)律進行定性、定位和定量研究的科學，是介于這些學科之間的一門邊緣科學。組織化學自出現(xiàn)以來，已取得了長足的發(fā)展。這與相關(guān)學科的發(fā)展是分不開的，其中細胞生物學、生物化學以及分子生物學是組織化學形成和發(fā)展的基礎(chǔ)。第一章

緒論組織化學（hist4一、組織化學發(fā)展簡史

組織化學是在組織學和化學的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，它的歷史相當悠久。早在十九世紀，人們把顯微鏡與化學技術(shù)結(jié)合起來，開始觀察組織中的化學反應。如法國植物學家F.V.Raspail（1826）介紹了植物花和果受精過程中的碘淀粉反應；M.Perls（1867）用普魯士藍顯示出鐵；A.N.F.Millon(1844)敘述了蛋白質(zhì)反應；R.Fürnrohr（1850）論述了纖維素的氯鋅碘法；一、組織化學發(fā)展簡史組織化學是在組織學和化5

Klebs(1868)和H.Stuve1872)用愈創(chuàng)木酯酊同膿作用產(chǎn)生藍色證明組織中有過氧化物酶的存在；P.Ehrlich(1885)發(fā)現(xiàn)了細胞色素氧化酶；R.Heidenhain(1868)指出動質(zhì)（ergastoplasm）—核糖核酸是一種嗜鹼性物質(zhì)，可被醋酸沉淀；F.Miescher(1873)利用甲綠對核染色質(zhì)的選擇性親和力，分離出核染色質(zhì)。

Klebs(1868)和H.Stuve1872)用愈創(chuàng)6自A.Bencke(1862)將苯氨染料用于組織學領(lǐng)域，許多研究者在組織中應用了染色反應，相繼各種蛋白質(zhì)被染色出來。到19世紀末，膠原蛋白染色，脂肪的蘇丹Ⅲ染色以及組織中金屬鹽類的顯色等技術(shù)方法得到發(fā)展。但是由于化學知識的貧乏和顯微鏡技術(shù)的停滯在一定時期限制了組織化學的發(fā)展。自A.Bencke(1862)將苯氨染料用于組720世紀30年代，隨著生物化學的發(fā)展和電子顯微鏡技術(shù)的應用，組織化學迎來了復興時代。自從E.Takamatsu（高松英雄）和G.Gomori1939年同時證明了鹼性磷酸酶的組織化學方法，以后的30年間，酶組織化學得到了飛速發(fā)展，高松證明了磷酰胺酶、ATP酶；Gomori設(shè)計了酸性磷酸酶、脂酶、酯酶等組織化學證明法。

20世紀30年代，隨著生物化學的發(fā)展和電子顯微鏡技術(shù)的應8此間，金屬鹽法，硫化鈷法，偶氮色素法，偶氮色素四唑鹽法（tetrazoliumsaltsmethod）以及磷酸化酶組織化學證明法等相繼問世。特別是H.Scheldon和D.Brandes等人把電鏡與酶組織化學結(jié)合起來，以金屬沉淀法觀察了酸性磷酸酶和鹼性磷酸酶，奠定了電鏡酶組織化學（electronmicroscopeenzymehistochemistry）基礎(chǔ)。后來A.M.Seligman(1967)提出鋨黑化法（Osmificationmethod）進一步闡述了電鏡組織化學的基本原理和反應過程。

此間，金屬鹽法，硫化鈷法，偶氮色素法，偶氮色素四唑鹽法（91950年A.H.Coons等人提出了熒光抗體法，從而把免疫學引入組織化學實驗中，后來P.K.Nakane，S.Avrameas和L.A.Sternberger等人以辣根過氧化物酶為標記物對酶進行觀察，創(chuàng)立了酶標抗體法，從而為組織化學開辟了新途徑。

1950年A.H.Coons等人提出了熒光抗體法，從10

隨著分子生物學的發(fā)展，1969年人們把分子雜交技術(shù)應用到組織切片和細胞標本上，開始探索原位雜交技術(shù)，經(jīng)過30年不斷應用、完善和發(fā)展，特別是探針制備與標記物兩大關(guān)鍵技術(shù)的突破，目前原位雜交技術(shù)已廣泛應用于遺傳學、病毒學、神經(jīng)內(nèi)分泌學、病理學、免疫學和發(fā)育生物學等各個領(lǐng)域，顯示出巨大的應用潛力。

隨著分子生物學的發(fā)展，1969年人們把分子雜交技11

現(xiàn)代組織化學已經(jīng)滲透和應用于生命科學的許多學科，經(jīng)過近幾十年的發(fā)展，產(chǎn)生了許多分支，如核酸與核蛋白、蛋白質(zhì)與氨基酸、脂類與脂蛋白、碳水化合物與粘蛋白及粘多糖、無機物組織化學、酶組織化學電鏡組織化學、熒光組織化學、免疫組織化學、同工酶組織化學、定量組織化學、原位雜交組織化學和放射自顯影技術(shù)等?？傊?，現(xiàn)代組織化學的概念已經(jīng)遠遠超過了原有范圍，無論從理論、內(nèi)容、技術(shù)手段、研究范圍都比過去更廣泛、更深入。

現(xiàn)代組織化學已經(jīng)滲透和應用于生命科學的許多學科，12二、組織化學技術(shù)的基本要求

1．盡可能地保持組織和細胞生前的形態(tài)結(jié)構(gòu)、化學成分和酶的活性。為此必須選擇適當?shù)墓潭ㄒ汉颓‘數(shù)奶幚矸椒?，如冷凍干燥、冰凍替代、恒冷箱切片、振動切片等?．化學反應要求在細胞或組織內(nèi)進行，須有定位的準確性。為此必須控制反應的時間和條件，使反應的產(chǎn)物不移位，不彌散。

二、組織化學技術(shù)的基本要求1．盡可能地保持組織和細胞生133．反應物須有顯色性和定量的可能性，即必須是有色的沉淀或結(jié)晶，沉淀顆粒細小連續(xù)、色深、不溶，并能保留在原位上。顏色深度要與物質(zhì)含量或酶的活性具有一定的比例關(guān)系。4．反應物要有穩(wěn)定性和重復性，以利于觀察研究和驗證。5．反應物有靈敏性和特異性,以利于對比觀察。6．反應產(chǎn)物有對照，否則難以判斷其結(jié)果的可靠性。3．反應物須有顯色性和定量的可能性，即必須14第二章組織化學基本理論

組織化學是運用物理和化學的原理、技術(shù)研究組織與細胞內(nèi)的化學成分及其反應，對這些化學成分進行定性、定位及其定量并研究其變化規(guī)律的科學。它是介于組織學、細胞學與生物化學之間的一門邊緣科學。人們對生物組織的研究沿著兩條主要途徑發(fā)展：一條途徑是對顯微鏡下可分辨的越來越細小的形態(tài)結(jié)構(gòu)進行描述；另一條途徑是著力分離和描述具有重要生物學意義的物質(zhì)，如核酸、蛋白質(zhì)、脂類及碳水化合物等。由此進一步了解生命活動的本質(zhì)規(guī)律。兩條途徑的研究結(jié)果互相處近，互相補充，并在細胞、亞細胞乃至分子水平上統(tǒng)一起來，就形成了現(xiàn)代組織化學。

第二章組織化學基本理論組織化學是運用物理和15

組織化學源于組織學、細胞學和生物化學；但也有別于這些學科。組織化學與組織學不同：組織學的著眼點是組織與細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)，組織學技術(shù)的要求是盡可能保持組織和細胞的微細結(jié)構(gòu)。而組織化學的著眼點是組織與細胞內(nèi)化學成分的組成，組織化學技術(shù)的基礎(chǔ)是已知的化學反應。

組織化學源于組織學、細胞學和生物化學；但也有別于16

組織化學與生物化學也有區(qū)別：雖然二者都著眼于組織與細胞內(nèi)的化學組成成分及其含量，但生物化學研究常將組織破壞、制成勻漿、然后進行化學成分的測定，其化學反應主要在試管內(nèi)進行故其定位性能差；而組織化學技術(shù)則要求盡可能在原位顯示化學成分，故其定位、定位性能好。組織化學的發(fā)展借助了許多物理學技術(shù)，特別是顯微鏡技術(shù)、電鏡組織化學、電鏡細胞化學、熒光組織化學以及定量組織化學等，都是基于物理學技術(shù)發(fā)展起來的組織化學分支。

組織化學與生物化學也有區(qū)別：雖然二者都著眼于組織17一、組織化學的特征

組織化學是應用物理的和化學的方法來查明細胞組織的化學成分；是用組織學、化學、物理學原理研究細胞組織的結(jié)構(gòu)、功能與化學的關(guān)系；是對細胞組織成分的勘察、定位、定性、定量的特征來認識細胞組織結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。因此，它具有較強的特征性。

一、組織化學的特征組織化學是應用物理的和化學的方18

1.

組織化學的要求組織化學是建立在組織細胞形態(tài)學、生物物理學、生物化學及分子生物學學科基礎(chǔ)上的一門邊緣學科，因此組織化學研究具有如下要求：（1）要求形態(tài)結(jié)構(gòu)真實完整。（2）要求顯色全過程均屬于化學反應。（3）要求化學反應在組織細胞的原位被顯示（4）要求弄清化學成分與形態(tài)結(jié)構(gòu)及空間的關(guān)系。

1.

組織化學的要求192．研究方法組織化學的研究方法隨著現(xiàn)代物理、化學技術(shù)的發(fā)展而不斷更新，不斷增多?？傮w說來，可分為兩大類：一類是分離分析法，另一類是原位分析法。（1）分離分析法分離分析法是將組織細胞的微小器官從器官、組織、細胞內(nèi)原位分離出來，測定其化學成分和分析化學組成與組織細胞的關(guān)系。其中包括勻漿超速離心及分層分析法和顯微解剖分析，即組織切片的微量化學分析法。

2．研究方法20

（2）原位分析法

組織細胞在器官原位上不經(jīng)分離，用化學試劑與組織細胞內(nèi)的某些物質(zhì)進行化學反應，最終在局部呈現(xiàn)有色反應，通過顯微鏡及其他儀器，如分光光度計、熒光顯微鏡等組織細胞內(nèi)的化學反應進行定位、定性和定量研究。常用的方法包括：①組織細胞吸收光譜分析法。②熒光分析法。③放射自顯影術(shù)。（2）原位分析法21二、組織化學實驗的基本條件

組織中的各種物質(zhì)可籍特殊的化學反應被勘定。組織化學需要各種化學試劑，許多著名的組織化學研究室均有合成化學試劑的實驗室，以保證創(chuàng)建或改進組織化學的技術(shù)方法。良好的組織化學方法必須具備下列條件：

二、組織化學實驗的基本條件組織中的各種物質(zhì)可籍221、反應要具有專一性。2、高度穩(wěn)定性、重復性。3、必須保持組織結(jié)構(gòu)的完整性。4、能夠作對照實驗。5、反應產(chǎn)物必須呈現(xiàn)顏色。6、反應結(jié)果必須是不溶性的有色沉積。7、必須已知化學反應的全過程及影響反應的理化因素。8、必須了解制片的過程對組化反應的影響。1、反應要具有專一性。23三、組織化學的基本原理

研究組織細胞的化學及其化學反應機制是為了了解機體器官、組織、細胞生理和病理功能的一種必要方法。組織化學是用物理學和化學技術(shù)研究組織與細胞內(nèi)的化學成分，并觀察這些化學成分的定性、定位、定量與變化規(guī)律的科學。它的理論基礎(chǔ)是在已知的化學反應基礎(chǔ)上，嚴格控制其化學反應過程的科學。諸如蛋白質(zhì)、核酸、碳水化合物、脂類、無機鹽及酶類等（具體的反應原理見第4、5、6章）。三、組織化學的基本原理研究組織細胞的化學及其化學24組織化學技術(shù)教程

（內(nèi)部教材，僅供參考）組織化學技術(shù)教程（內(nèi)部教材，僅供參考）25序言

現(xiàn)代組織化學是介入細胞生物學、組織形態(tài)學、化學與生物化學及分子生物學之間的一門新興邊緣學科，它已滲透和應用于生命科學的許多學科。近幾十年來，組織化學的發(fā)展，突飛猛進，日新月異，已產(chǎn)生了許多分支，而各類分支雖有特點，但都源于組織化學。因此，組織化學已成為醫(yī)學生物學科研過程中必備知識之一。序言現(xiàn)代組織化學是介入細胞生物學、26

為使廣大生物醫(yī)學青年教師、研究生、醫(yī)學高等職業(yè)技術(shù)學校?？粕坝嘘P(guān)實驗技術(shù)人員盡快掌握組織化學基本技術(shù)，作者借鑒其他兄弟院校之經(jīng)驗，編寫了簡明的組織化學技術(shù)教程。由于時間倉促，有些知識未編入其中，有待完善。書中疏漏，不妥之處，望廣大讀者批評指正。

穆長征

2003年10月為使廣大生物醫(yī)學青年教師、研究生、醫(yī)學27第一章

緒論

組織化學（histochemistry）是運用物理學、化學、免疫學、分子生物學等原理與技術(shù)，對組織與細胞的化學成分、化學反應及其變化規(guī)律進行定性、定位和定量研究的科學，是介于這些學科之間的一門邊緣科學。組織化學自出現(xiàn)以來，已取得了長足的發(fā)展。這與相關(guān)學科的發(fā)展是分不開的，其中細胞生物學、生物化學以及分子生物學是組織化學形成和發(fā)展的基礎(chǔ)。第一章

緒論組織化學（hist28一、組織化學發(fā)展簡史

組織化學是在組織學和化學的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，它的歷史相當悠久。早在十九世紀，人們把顯微鏡與化學技術(shù)結(jié)合起來，開始觀察組織中的化學反應。如法國植物學家F.V.Raspail（1826）介紹了植物花和果受精過程中的碘淀粉反應；M.Perls（1867）用普魯士藍顯示出鐵；A.N.F.Millon(1844)敘述了蛋白質(zhì)反應；R.Fürnrohr（1850）論述了纖維素的氯鋅碘法；一、組織化學發(fā)展簡史組織化學是在組織學和化29

Klebs(1868)和H.Stuve1872)用愈創(chuàng)木酯酊同膿作用產(chǎn)生藍色證明組織中有過氧化物酶的存在；P.Ehrlich(1885)發(fā)現(xiàn)了細胞色素氧化酶；R.Heidenhain(1868)指出動質(zhì)（ergastoplasm）—核糖核酸是一種嗜鹼性物質(zhì)，可被醋酸沉淀；F.Miescher(1873)利用甲綠對核染色質(zhì)的選擇性親和力，分離出核染色質(zhì)。

Klebs(1868)和H.Stuve1872)用愈創(chuàng)30自A.Bencke(1862)將苯氨染料用于組織學領(lǐng)域，許多研究者在組織中應用了染色反應，相繼各種蛋白質(zhì)被染色出來。到19世紀末，膠原蛋白染色，脂肪的蘇丹Ⅲ染色以及組織中金屬鹽類的顯色等技術(shù)方法得到發(fā)展。但是由于化學知識的貧乏和顯微鏡技術(shù)的停滯在一定時期限制了組織化學的發(fā)展。自A.Bencke(1862)將苯氨染料用于組3120世紀30年代，隨著生物化學的發(fā)展和電子顯微鏡技術(shù)的應用，組織化學迎來了復興時代。自從E.Takamatsu（高松英雄）和G.Gomori1939年同時證明了鹼性磷酸酶的組織化學方法，以后的30年間，酶組織化學得到了飛速發(fā)展，高松證明了磷酰胺酶、ATP酶；Gomori設(shè)計了酸性磷酸酶、脂酶、酯酶等組織化學證明法。

20世紀30年代，隨著生物化學的發(fā)展和電子顯微鏡技術(shù)的應32此間，金屬鹽法，硫化鈷法，偶氮色素法，偶氮色素四唑鹽法（tetrazoliumsaltsmethod）以及磷酸化酶組織化學證明法等相繼問世。特別是H.Scheldon和D.Brandes等人把電鏡與酶組織化學結(jié)合起來，以金屬沉淀法觀察了酸性磷酸酶和鹼性磷酸酶，奠定了電鏡酶組織化學（electronmicroscopeenzymehistochemistry）基礎(chǔ)。后來A.M.Seligman(1967)提出鋨黑化法（Osmificationmethod）進一步闡述了電鏡組織化學的基本原理和反應過程。

此間，金屬鹽法，硫化鈷法，偶氮色素法，偶氮色素四唑鹽法（331950年A.H.Coons等人提出了熒光抗體法，從而把免疫學引入組織化學實驗中，后來P.K.Nakane，S.Avrameas和L.A.Sternberger等人以辣根過氧化物酶為標記物對酶進行觀察，創(chuàng)立了酶標抗體法，從而為組織化學開辟了新途徑。

1950年A.H.Coons等人提出了熒光抗體法，從34

隨著分子生物學的發(fā)展，1969年人們把分子雜交技術(shù)應用到組織切片和細胞標本上，開始探索原位雜交技術(shù)，經(jīng)過30年不斷應用、完善和發(fā)展，特別是探針制備與標記物兩大關(guān)鍵技術(shù)的突破，目前原位雜交技術(shù)已廣泛應用于遺傳學、病毒學、神經(jīng)內(nèi)分泌學、病理學、免疫學和發(fā)育生物學等各個領(lǐng)域，顯示出巨大的應用潛力。

隨著分子生物學的發(fā)展，1969年人們把分子雜交技35

現(xiàn)代組織化學已經(jīng)滲透和應用于生命科學的許多學科，經(jīng)過近幾十年的發(fā)展，產(chǎn)生了許多分支，如核酸與核蛋白、蛋白質(zhì)與氨基酸、脂類與脂蛋白、碳水化合物與粘蛋白及粘多糖、無機物組織化學、酶組織化學電鏡組織化學、熒光組織化學、免疫組織化學、同工酶組織化學、定量組織化學、原位雜交組織化學和放射自顯影技術(shù)等?？傊?，現(xiàn)代組織化學的概念已經(jīng)遠遠超過了原有范圍，無論從理論、內(nèi)容、技術(shù)手段、研究范圍都比過去更廣泛、更深入。

現(xiàn)代組織化學已經(jīng)滲透和應用于生命科學的許多學科，36二、組織化學技術(shù)的基本要求

1．盡可能地保持組織和細胞生前的形態(tài)結(jié)構(gòu)、化學成分和酶的活性。為此必須選擇適當?shù)墓潭ㄒ汉颓‘數(shù)奶幚矸椒?，如冷凍干燥、冰凍替代、恒冷箱切片、振動切片等?．化學反應要求在細胞或組織內(nèi)進行，須有定位的準確性。為此必須控制反應的時間和條件，使反應的產(chǎn)物不移位，不彌散。

二、組織化學技術(shù)的基本要求1．盡可能地保持組織和細胞生373．反應物須有顯色性和定量的可能性，即必須是有色的沉淀或結(jié)晶，沉淀顆粒細小連續(xù)、色深、不溶，并能保留在原位上。顏色深度要與物質(zhì)含量或酶的活性具有一定的比例關(guān)系。4．反應物要有穩(wěn)定性和重復性，以利于觀察研究和驗證。5．反應物有靈敏性和特異性,以利于對比觀察。6．反應產(chǎn)物有對照，否則難以判斷其結(jié)果的可靠性。3．反應物須有顯色性和定量的可能性，即必須38第二章組織化學基本理論

組織化學是運用物理和化學的原理、技術(shù)研究組織與細胞內(nèi)的化學成分及其反應，對這些化學成分進行定性、定位及其定量并研究其變化規(guī)律的科學。它是介于組織學、細胞學與生物化學之間的一門邊緣科學。人們對生物組織的研究沿著兩條主要途徑發(fā)展：一條途徑是對顯微鏡下可分辨的越來越細小的形態(tài)結(jié)構(gòu)進行描述；另一條途徑是著力分離和描述具有重要生物學意義的物質(zhì)，如核酸、蛋白質(zhì)、脂類及碳水化合物等。由此進一步了解生命活動的本質(zhì)規(guī)律。兩條途徑的研究結(jié)果互相處近，互相補充，并在細胞、亞細胞乃至分子水平上統(tǒng)一起來，就形成了現(xiàn)代組織化學。

第二章組織化學基本理論組織化學是運用物理和39

組織化學源于組織學、細胞學和生物化學；但也有別于這些學科。組織化學與組織學不同：組織學的著眼點是組織與細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)，組織學技術(shù)的要求是盡可能保持組織和細胞的微細結(jié)構(gòu)。而組織化學的著眼點是組織與細胞內(nèi)化學成分的組成，組織化學技術(shù)的基礎(chǔ)是已知的化學反應。

組織化學源于組織學、細胞學和生物化學；但也有別于40

組織化學與生物化學也有區(qū)別：雖然二者都著眼于組織與細胞內(nèi)的化學組成成分及其含量，但生物化學研究常將組織破壞、制成勻漿、然后進行化學成分的測定，其化學反應主要在試管內(nèi)進行故其定位性能差；而組織化學技術(shù)則要求盡可能在原位顯示化學成分，故其定位、定位性能好。組織化學的發(fā)展借助了許多物理學技術(shù)，特別是顯微鏡技術(shù)、電鏡組織化學、電鏡細胞化學、熒光組織化學以及定量組織化學等，都是基于物理學技術(shù)發(fā)展起來的組織化學分支。

組織化學與生物化學也有區(qū)別：雖然二者都著眼于組織41一、組織化學的特征

組織化學是應用物理的和化學的方法來查明細胞組織的化學成分；是用組織學、化學、物理學原理研究細胞組織的結(jié)構(gòu)、功能與化學的關(guān)系；是對細胞組織成分的勘察、定位、定性、定量的特征來認識細胞組織結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。因此，它具有較強的特征性。

一、組織化學的特征組織化學是應用物理的和化學的方42

1.

組織化學的要求組織化學是建立在組織細胞形態(tài)學、生物物理學、生物化學及分子生物學學科基礎(chǔ)上的一門邊緣學科，因此組織化學研究具有如下要求：（1）要求形態(tài)結(jié)