PAGEPAGE2JIUJIANGUNIVERSITY實驗論題目蘇云金芽孢桿菌生物農(nóng)藥(Bt制劑)的制備、伴孢晶體的分離純化及殺蟲活性院系生命科學學院專業(yè)生物技術(shù)姓名樊曉樂、嚴學芬、王偉、周明宣、鄒紅虹班級B0933指導教師張炳火二零一一年十一月PAGEPAGE5摘要：蘇云金芽孢桿菌是目前世界上研究最多、產(chǎn)量最大、應(yīng)用范圍最廣的微生物殺蟲劑，具有專一性強、對人畜無害、防治效果好、易生物降解及無殘毒等優(yōu)點。本試驗采用固體培養(yǎng)，對一株蘇云金芽孢桿菌進行了發(fā)酵，制備了Bt制劑，對伴孢晶體進行了分離純化，采用菜地試驗，檢測了Bt制劑和伴孢晶體對白菜蟲害的防治效果。關(guān)鍵詞：蘇云金芽孢桿菌（Bt）；伴孢晶體；殺蟲活性前言蘇云金芽孢桿菌（Bacillusthuringiensis,簡稱Bt）是一種革蘭氏陽性細菌，其菌體為短桿狀，生鞭毛，單生或形成短鏈。它在芽孢形成過程中產(chǎn)生稱為δ-內(nèi)毒素的殺蟲伴胞晶體蛋白(控制合成這種蛋白質(zhì)的基因在質(zhì)粒上），這些蛋白具有很高的殺蟲活性。Bt由于具有專一性強、對人畜無害、防治效果好、生物降解無殘毒、所用原料簡單等優(yōu)點，在蟲害防治中發(fā)揮著越來越重要的作用，隨著對Bt研究的深入，Bt的基因改造、毒理學研究、殺蟲機理、對人類的安全性等方面的研究都對高純度的Bt伴胞晶體提出了極大的需求。因此，Bt伴胞晶體的分離純化方法逐步得到了發(fā)展，如等密度梯度離心法、液體雙相分離法、等電點沉淀法、離子交換分離法、堿裂解法、高速離心法和生物物理法等。本實驗采用2種液體培養(yǎng)基、2種培養(yǎng)條件對蘇云金芽孢桿菌進行培養(yǎng)。鏡檢觀察當90％以上的芽孢脫落時處理菌體，經(jīng)堿液裂解后比較等電點沉淀和液體雙相分層法提取Bt蛋白的收率和純度。1材料與方法1.1菌種蘇云金芽孢桿菌為九江學院生命科學學院微生物實驗室保藏。1.2培養(yǎng)基種子培養(yǎng)基：牛肉膏0.5%,蛋白胨1.0%,NaCl1.0%,調(diào)pH7.2左右,121℃滅菌30min。發(fā)酵培養(yǎng)基：牛肉膏0.5%,蛋白質(zhì)1.0%,葡萄糖0.3%,NaCl0.2%,MgSO4·7H2O0.03%,K2HPO40.03%,MnSO40.005%,調(diào)pH7.5,121℃滅菌30min,滅菌后pH7.3。1.3實驗儀器與藥品實驗儀器：培養(yǎng)皿，離心機，試管，接種針，移液槍，高壓蒸汽滅菌鍋。實驗藥品：牛肉膏，蛋白胨，NaCl，葡萄糖，MgSO4·7H2O，K2HPO4，MnSO4。1.4培養(yǎng)方法1.4.1種子液的培養(yǎng)將蘇云金芽孢桿菌孢子接入種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)1.4.2菌株發(fā)酵將種子培養(yǎng)基中的蘇云金芽孢桿菌接入發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵1.4.3Bt制劑的制作將蘇云金芽孢桿菌離心獲得蛋白質(zhì)粗制品1.5蘇云金芽孢桿菌伴孢晶體的分離純化將裂解得到的溶液冷凍離心（4℃、4000r/min）30min后，除去上清液，將芽孢與伴孢晶體充分分離。用無菌水洗滌沉淀，除去剩余的芽孢與雜質(zhì)。用0.5mol/LNaCL洗滌沉淀，消除晶體中內(nèi)生蛋白酶對晶體的被特意降解。得到的懸液繼續(xù)沉淀30min，去除上清液，像沉淀中加1mol/LNaCL+0.01%TritionX-100制成孢晶懸液，在0~4℃靜置24h。將靜置后的懸浮液離心，然后溶于0.001mol/LNaCl+0.01%TritionX-100+2%甘油中，靜置10min離心，沉淀制成水懸液。將利用高速離心法得到的水懸液裝入透析袋中透析4h，已除去高速離心中引入的鹽雜質(zhì)，再放入冰箱中冷凍過夜，即得到淡黃色的伴孢晶體粉末。1.6伴孢晶體蛋白對菜青蟲的防治試驗1.在菜地取三個邊長為20cm的正方形，分別做標記為Bt制劑、伴孢晶體和對照。2.按照標記分別撒上Bt制劑、伴孢晶體和無菌水。3.十五天后觀察并記錄分別撒上Bt制劑、伴孢晶體和無菌水的白菜的長勢，統(tǒng)計眼蟲數(shù)量。2結(jié)果與分析2.1Bt制劑將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到離心管中4000r/min離心30min，收集沉淀，用0．5mol／LNaC1和生理鹽水各洗滌1次，離心(4000／min)30min，收集沉淀，取一半沉淀，與適量土混合，放在恒溫干燥箱中，即得。2.2伴孢晶體的提取及晶形檢測取另一半沉淀，稱沉淀重量，以0.070g／mL加入蒸餾水混勻轉(zhuǎn)入燒杯中進行磁力攪拌，除去泡沫，然后轉(zhuǎn)入分液漏斗中，按體積比懸液：1％Na2SO4：CCl4=7:6:7，加入振勻10min，靜置8min．將水相吸出離心(4800r/min)10min，去上清液，沉淀每管用5％的丙酮洗滌離心(4800r/min)10min重復3次．再用蒸餾水洗滌離心(4000r／min)10min3次，得沉淀晶體蛋白透析脫鹽，將沉淀真空冷凍干燥-4℃保存?zhèn)溆茫?.3Bt制劑及伴孢晶體對菜青蟲的防治效果表1Bt制劑及伴孢晶體對菜青蟲的防治效果稀釋倍數(shù)Bt制劑伴孢晶體對照(無菌水)死亡個數(shù)961死亡率90%60%1%平均相對死亡率90%60%1%1）空白對照組：小白菜長勢不佳，對照菜地上白菜有20個蟲眼。2）Bt制劑組：小白菜長勢良好，實驗白菜上有8個蟲眼。3）伴孢晶體菌懸液組：小白菜長勢好，實驗白菜上僅有2個蟲眼。3結(jié)論與討論1.根據(jù)試驗結(jié)果表明固體發(fā)酵培養(yǎng)制備Bt制劑比較適宜，但對于制備伴孢晶體而言，相對于用液體發(fā)酵培養(yǎng)制備的殺蟲效果略差；2.Bt制劑和伴孢晶體菌懸液對小菜蛾蟲都有很好的殺蟲活性，殺毒15d，分離純化后的伴孢晶體的殺蟲活性比Bt制劑要好。參考文獻1．馬虹，黃潔夫-蘇云金芽孢桿菌伴孢晶體蛋白提取方法比較研究-湖南師范大學自然科學學報2.湖南師范大學自然科學學報-蘇云金芽孢桿菌伴孢晶體蛋白提取方法比較研究3.羅志軍．Bt毒蛋白基因工程研究進展[J]．重慶師專學報，2000(2)：89～914.朱仕房，楊曜中．雙水相體系分離蘇云金芽孢桿菌伴孢晶體的研究EJ]，世界農(nóng)藥，2000，22(